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本研究以野生敏感型禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)菌株(WW)为材料,经药剂筛选和UV诱导,分别获得了抗戊唑醇(Tebuconazole)禾谷丝核菌菌株(WX1、WX2和WWL)。戊唑醇对3个菌株的EC50值由0.0120μg/mL分别增加到0.1226μg/mL、0.2585μg/mL和0.4004μg/mL,抗性分别为10.2倍、21.5倍33.4倍。
以获得的抗性菌株和敏感菌株为材料,采用菌落直径法和菌丝干重法研究了查彼克(Czapek)培养基中不同营养源、pH值和温度对抗性和敏感菌株生长的影响,以探明抗性菌株和敏感菌株之间生理适合度的差异。发现在不同碳源条件下,所有菌株都在蔗糖、甘油和葡萄糖中生长最快,在木糖和果糖中生长相对较慢;在相同碳源条件下,高抗菌株(WWL)的生长速度小于敏感菌株(WW)和中抗菌株(WX1和WX2),WX1、WX2和WW之间的生长速度差异不明显。在不同氮源条件下,所试菌株均能较好利用硝酸盐、亚硝酸盐、精氨酸和丙氨酸,不能充分利用胱氨酸;在同一氮源条件下,WWL的生长速度小于WW、WX1和WX2,而WX1、WX2和WW之间差异不明显。所有供试菌株在pH值6、7、11、12时生长均较快,在pH值为4和10时生长最慢;当pH值为4时,WWL的菌落直径要明显大于WX1、WX2和WW;当pH为5、11和12时,WWL的菌落直径要明显小于其它菌株,pH值为6、7、8、9和10时,各菌株间菌落直径差异不明显。所有菌株均是在20和25℃时生长速度最快,在10和30℃时生长最慢,基本不能生长。在相同的温度条件下,WWL的菌落直径要相对高于WX1、WX2和WW,但WX1、WX2和WW之间的菌落直径差异不明显。
不同浓度戊唑醇处理抗性与敏感菌株后,体内过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性与抗药性呈一定的相关性。用戊唑醇处理所有菌株,24h内所有菌株的POD活性不断升高,抗性菌株的POD活性明显高于敏感菌株,其中WWL的活性最高;至24h,用25mg/L戊唑醇处理后WWL、WX2、WX1和WW的POD活性分别为44.16、30.64、20.56和17.44u/g·min,均达最高值。PAL活性表现出先迅速上升又迅速下降的趋势,以25mg/L处理1.5h时WWL活性最高,达7020u/g·h;WX2、WX1和WW的PAL活性值也分别为6375、5800和5370u/g·h;此后所有处理的PAL活性随着时间迅速下降,至24h时达到最低值,各菌株活性大小排列依次为WWL>WX2>WX1>WW。酯酶同工酶和可溶性蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现,抗性菌株和敏感菌株无论在谱带数上还是量上都存在明显的差异。
在相同的渗透压环境下,敏感菌株对渗透压较抗性菌株更为敏感。在高渗环境下不同抗性水平菌株间渗透压的敏感性有一定的差异,但在中渗环境下不同抗性水平菌株的敏感性差异不大;敏感菌株只对低渗透压和高渗透压相对较为敏感。当用不同浓度的戊唑醇处理后,抗性菌株能在较短的时间里(1h)渗出更多的电解质;但最终敏感菌株的相对渗率要明显高于抗性菌株。用高浓度和低浓度的戊唑醇分别处理抗性菌株后,前者的相对渗率明显高于后者。
采用反相高效液相色谱法(HPLC),建立了检测禾谷丝核菌菌丝吸收戊唑醇的方法。比较了用戊唑醇处理后,敏感和不同抗性水平菌株对戊唑醇的吸收及药剂在菌体内的积累差异。在0.5mg/L剂量处理下,处理后24.0h,敏感菌株体内戊唑醇的浓度比高抗菌株高127.74%,比两个中抗菌株分别高47.72%和7.83%。因戊唑醇在抗性菌株体内的积累浓度明显低于敏感菌株,降低了药剂对菌体的实际作用浓度,从而表现出抗药性提高。
采用反相高效液相色谱法(HPLC)进行定量测定,比较了药剂处理后抗性与敏感菌株体内麦角甾醇和羊毛甾醇的含量变化。在正常条件下,所有菌株体内的两种甾醇含量无明显差异;当用戊唑醇处理后,所有菌株体内的麦角甾醇含量都明显下降,羊毛甾醇含量明显上升,且浓度越高越明显;当用高浓度的戊唑醇(0.25mg/L)处理后,WW体内的羊毛甾醇含量最高,达116.38μg/g菌丝鲜重;WWL的最低,仅为30.53μg/g菌丝鲜重;WX1和WX2的分别为36.47和30.53μg/g菌丝鲜重;麦角甾醇以WWL的含量最高,为231.28μg/g菌丝鲜重;WW、WX1和WX2的含量仅分别为57.97、157.72和144.78μg/g菌丝鲜重,分别是WWL的25.06%、68.19%和62.60%。
根据对已发表的丝状真菌的CYP51基因序列的保守区域,设计了一对简并引物,采用聚合酶链式反应(PCR)成功克隆到了WW、WX1、WWL的CYP51基因片断,将RWWCYP51片断与其它丝状真菌比对后发现,同源性为41.86%~52.0%,大于40%,属于P450家族。将3个菌株的核苷酸序列(RWWCYP51,RWX1CYP51,RWWLCYP51)进行比对发现,敏感菌株与中抗菌株和高抗菌株的片断序列在8、593、670、673位的核苷酸分别由T、A、T、A变为C、G、C、T,而高抗菌株和敏感、中抗菌株之间在核苷酸上有数十个碱基存在明显不同,且不是连续的。
由于CYP51片断是由简并引物扩增得到,且比较的结果只是片断而不是全长基因,所以不能肯定这些变化与禾谷丝核菌对戊唑醇的抗性有关,但本研究所获得的CYP51基因片断为进一步的研究抗性分子机制奠定了基础。