论文部分内容阅读
抗体是一种重要的生物大分子,对于人体免除细菌、病毒等病原体的侵扰起着非常重要的作用。人类多克隆抗体在诸多疾病的治疗过程中显示出了巨大的功效,但由于它来源的局限性限制了其在临床应用中的发展。转基因技术的发展有可能使动物获得人的免疫球蛋白基因,从而大量生产人的抗体,即利用基因打靶技术,敲除牛的免疫球蛋白基因,同时敲入人的免疫球蛋白基因,牛生产的抗体就可能转变成表达人免疫球蛋白基因的抗体,可用来给人体注射,治疗艾滋病、癌症等目前不能治疗的恶性疾病。 本研究的主要目的是获得关于牛免疫球蛋白lambda轻链恒定区的序列,为获得敲除免疫球蛋白基因的转基因牛打下基础。通过筛选牛基因组DNA文库,获得含有牛免疫球蛋白lambda轻链的阳性克隆,进而获得免疫球蛋白lambda轻链C区的序列,主要工作包括: 1、以牛lambda轻链C_λ区保守序列为探针,利用PCR与原位杂交的方法,从牛λ噬菌体基因组文库中筛选得到两个含有牛免疫球蛋白lambda轻链C_λ区的阳性克隆,酶切分析表明他们分别含有大小为7kb和9kb的外源片段。采用PCR筛选系统,从牛的BAC基因组文库中筛选得到一个含有牛免疫球蛋白lambda轻链C区的阳性克隆。酶切后的脉沖电泳(PFGE)结果表明其插入片度长度为130kb左右。 2、为研究lambda轻链C_λ的数量和Igλ的结构,将得到的BAC阳性克隆用不同限制性内切酶酶切,然后与408bp的C_λ区特异性探针杂交,Southern Blot杂交结果显示有7条阳性条带。这一结果表明牛免疫球蛋白lambda轻链至少含有7个C_λ区,跨越了轻链大小约40kb的范围。 3、将筛选得到的λ噬菌体阳性菌斑和BAC阳性克隆酶切后的阳性条带分别回收,连接于克隆载体pGEM-3zf(+)上,得到5个重组质粒:pGEM-3zf2.8,pGEM-3zfS1,pGEM-3zfS2,pGEM-3zfS3和pGEM-3zfS4,含有C_λ的插入片段的长度分别为2660bp,1682bp,2514bp,1860bp和1806bp。 4、利用获得的五个阳性克隆片段的序列,设计六对不同的引物进行PCR扩增,分析扩增产物彼此间的关系,结果表明阳性片段S3,S2和S4依次相邻,分布在牛lambda轻链上15kb的范围内。 5、将本研究得到牛的4个C_λ基因序列与人的7个C_λ和小鼠的4个C_λ进行同源性比较发现,牛IgC_λ与小鼠IgC_λ的同源性高于牛IgC_λ与人IgC_λ的同源性,从进化起源上看,牛与小鼠可能有更近的亲缘关系。