论文部分内容阅读
棉花(Gossypium spp.)是最重要的纤维作物,随着植棉区向北方盐碱地、新疆、内蒙古、沿海滩涂发展,棉花非生物胁迫研究成为棉花育种中的重要内容之一。PUB是含有U-box结构域的一类泛素连接酶,在多种植物中研究发现PUB蛋白参与非生物胁迫,棉花中PUB蛋白和基因的研究较少,为探究PUB在棉花非生物胁迫中的作用,本研究鉴定了棉花基因组中PUB基因家族成员,分析其在棉花中的进化,以及不同组织中或不同胁迫下的表达模式,最后在陆地棉中克隆了一对同源基因,进行了初步功能验证。主要研究结果有以下几个方面:(1)以U-box结构域(PF04564)为参考,从已完成测序的四个棉种:雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)(D5)、亚洲棉(Gossypium arboreum)(A2)、陆地棉(Gossypium hirsutum)(AD1)和海岛棉(Gossypium barbadense)(AD2)基因组分别鉴定出93、96、185和208个PUB基因家族成员,基因结构分析发现棉花中PUB基因外显子数量在1-25不等,单个外显子的基因占有比例最大,约1/3。对单个棉种的PUB基因进化关系分析,都可分为5亚类I-V,PUB基因在D5、A2和AD1中的进化关系和在单个基因组中的进化一致,同样可分为5亚类ⅰ-ⅴ。(2)同源性分析显示D5内部有15对为片段重复,3对为串联重复;A2内部有25对为片段重复,2对为串联重复,D5和A2之间有143个同源基因对。AD1基因组中A亚组(A_t)内部有14个同源基因对,D亚组内(D_t)部有17个同源基因对,A_t和D_t之间有105个同源基因对,说明,在A2和D5种间杂交形成AD1的过程中,一部分同源基因可能只保留了其中一个拷贝。(3)运用陆地棉转录组数据构建GhPUB基因的表达谱,结果显示:只有3个GhPUB基因在根、茎和叶中表达量都较高,有21个基因在根、茎和叶中都几乎不表达,其余的基因在不同组织中表达具有偏向性。有22个GhPUB基因在盐、干旱、冷和热四种胁迫下表达量存在差异。(4)克隆GhPUB中的一对同源基因GhPUB85A和GhPUB45D,在干旱胁迫下,基因表达量在6 h附近达到最高,在低温和盐胁迫下在12 h附近达到最高,且在不同胁迫下表达量均表现出较明显的差异。VIGS(virus induced gene silencing)沉默GhPUB85A或GhPUB45D后,与对照相比其表达量明显下降,在不同基因沉默植株中同一基因的表达量没有差异,可能与GhPUB85A和GhPUB45D的相似度极高有关。(5)构建红色荧光蛋白融合表达载体,在烟草叶片中瞬时表达,GhPUB85A和GhPUB45D都定位到细胞膜。构建植物过表达载体转化拟南芥,获得6个转GhPUB85A的单T-DNA插入株系,11个转GhPUB45D的单T-DNA插入株系。