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处于围产期的奶牛由于能量需求的上升和干物质采食量的减少,造成奶牛能量负平衡状态(energy negative balance,NEB)。此时,脂肪细胞内脂肪动员迅速加剧并进一步发展为脂代谢紊乱,造成高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFAs)血症,它是围产期奶牛主要的临床病理学特征。而过量NEFAs的释放会导致奶牛各种生产疾病,如奶牛酮病、脂肪肝、氧化应激等,同时,高NEFAs的脂毒性也会严重损害奶牛生产健康。棕色脂肪细胞在动员脂肪,调节脂质代谢中具有重要作用,因此,探究奶牛棕色脂肪细胞中脂质代谢与奶牛高NEFAs血症的关系显得十分必要。MicroRNA(miRNA)是一类非编码的小RNA分子(约22个核苷酸),其最主要的作用是通过与靶基因mRNA 3’端的非编码区相结合,从而抑制靶基因的表达以调控细胞各项生理功能。MiRNA的作用十分广泛,研究发现,miRNA调节着哺乳动物大约30%-40%的基因。但是,奶牛棕色脂肪细胞在高NEFAs的miRNA调控机制却罕有报道。因此,本论文的研究目的旨在研究高NEFAs状态下,miRNA对奶牛棕色脂肪细胞的调节作用,为奶牛高NEFAs血症的防治提供新思路和策略。本研究首先向体外培养的原代棕色脂肪细胞(选用11天完全分化成熟的细胞)培养液中添加NEFAs(0 mmol/L,0.3 mmol/L,0.6 mmol/L,1.2 mmol/L,2.4mmol/L),模拟奶牛高NEFAs血症时的脂肪细胞状态。结果发现,当NEFAs浓度高于1.2 mmol/L时细胞内甘油三脂(Triacylglycerol,TG)的含量显著减少,培养液中甘油含量显著上升。为探究其内在调节机制,应用此模型,采用二代测序技术检测高NEFAs作用下(1.2 mmol/L)棕色脂肪细胞内miRNA表达谱的变化。测序结果发现,与空白对照组相比,bta-miR-novel3表达显著升高,甘油-3-磷酸酰转移酶1(glycerol-3-phosphate acyltransferases-1,GPAT1)表达显著降低。实时荧光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western Blotting,Western Blot)试验也进一步验证了上述结果。双荧光素酶报告基因实验结果表明,bta-miR-novel3和GPAT1之间的靶向关系。进一步研究发现,通过转染bta-miR-novel3模拟体(mimics),将bta-miR-novel3在奶牛棕色脂肪细胞内过表达,结果显示mimics组脂肪细胞内GPAT1表达量和胞内TG含量显著下降,培养液中甘油含量显著上升;转染bta-miR-novel3抑制剂(inhibitor)抑制bta-miR-novel3的表达时,结果显示inhibitor组脂肪细胞内GPAT1表达量和胞内TG含量显著增加,培养液中甘油含量显著下降。另外,用高浓度NEFAs(1.2 mmol/L)处理脂肪细胞,同时转染bta-miR-novel3 inhibitor抑制bta-miR-novel3的表达,结果显示相较NEFAs组,bta-miR-novel3 inhibitor组GPAT1的表达量和胞内TG含量得到回升,脂滴(Lipid droplets,LDs)变大,培养液中甘油含量下降。上述结果表明,通过抑制bta-miR-novel3的表达可以改善高浓度NEFAs(1.2 mmol/L)对棕色脂肪细胞脂肪蓄积能力的损害。综上所述,高浓度NEFAs会引起奶牛体外培养原代棕色脂肪细胞bta-miRnovel3的表达上调,而bta-miR-novel3则会通过抑制靶基因GPAT1的表达来抑制TG合成,从而加重NEFAs的产生,可能会进一步加重高NEFAs血症。