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研究目的外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy,TON)是临床上较为常见的致盲性眼外伤。本研究选择可重复多次应用的经巩膜电刺激(trans-sclera electrical stimulation,TsES)方式,在大鼠视神经钳夹伤(optic nerve crush,ONC)中研究延迟性TsES治疗对视网膜的神经保护作用,对这种治疗方式可能的神经保护作用机制进行深入研究。方法首先建立大鼠ONC伤动物模型。在ONC前7天经视上丘荧光金(Fluoro-gold,FG)逆行性标记视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC);之后在大鼠球后视神经1.5mm处钳夹视神经5秒制作ONC模型,在ONC后1天、3天、7天和14天,记录大鼠视网膜电图(electroretinography,ERG);对应时间点处死大鼠,取眼球做视网膜铺片,计数FG标记的存活RGC数量,计算RGC存活率,计数活化小胶质细胞数量;进一步通过免疫荧光组化方法,观察视网膜iba-1,GFAP的表达,同时检测8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxyguanine,8-OHG),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD-2)和醌氧化还原酶-1(quinone oxidoreductase 1,NQO-1)在视网膜中表达。Western检测,凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF),SOD-2 以及 NQO-1 表达的变化。第二,比较延迟性TsES在ONC模型中的作用。在大鼠ONC模型基础上,在ONC第3天,巩膜表面外置一对金电极给予电刺激治疗,电流强度分别为:0 μA(pad 对照组)、50 μA、100 μA 和 150 μA,电刺激频率为 20Hz,2.5ms/phase duration,单次治疗时间持续30分钟,电流为交流电。在ONC后第7天和第14天,记录大鼠ERG,处死大鼠做视网膜铺片,计数FG标记的存活RGC数量,比较不同组RGC存活数量以及存活率,比较各组活化小胶质细胞数量;第三,对延迟性TsES的视神经保护作用机制的探讨。在ONC第3天,给予电刺激治疗,电流强度为:100 μA,刺激频率为20Hz,2.5ms/phase duration,治疗时间持续30分钟,电流为交流电。在ONC后7天和14天处死大鼠。视网膜切片标本免疫荧光染色:检测iba-1和GFAP,SOD-2和NQO-1,促存活因子磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphor-serine/threonine protein kinase(p-AKT)),神经营养因子脑源性神经营养因子(brain derived neurothrophic factor,BDNF),成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2 FGF-2)在视网膜上表达的变化。进一步用Western检测TsES治疗对不同信号因子表达的影响,包括p-AKT,SOD-2 等。研究结果首先:大鼠ONC后1天、3天、7天和14天,FG标记RGC的存活率分别为:100%、98%、40%和15%。在ONC后3天开始小胶质细胞活化,在损伤后7天和14天小胶质细胞数量明显增多,2周可达464.01±75.45个/mm2。iba-1和GFAP表达均随着损伤时间而增强。免疫荧光染色结果表明ONC后1天和3天氧化损伤标志物8-OHG上调,抗氧化酶SOD-2下降。Western结果表明ONC后3天时凋亡诱导因子AIF相比正常组表达明显升高,ONC后1天NQO-1表达开始上调,3天时表达最高,之后开始下降。ERG结果为:视神经钳夹伤后7天和14天:PhNR幅值从视神经钳夹伤后1天就已经明显降低,伤后7天和14天,RGC细胞大量死亡,伴随着PhNR幅值明显降低,相比正常组差异有统计学意义。第二:荧光金标记RGC在ONC后7天时,模型组RGC存活率为34%,pad 对照组 36%,50 μA TsES 组 42%,100 μA TsES 组 50%,150 μATsES 组 39%。100 μA TsES组RGC存活率最高,与对照组比较差异有统计学意义。伤后2周时,模型组RGC存活率为13%,pad对照组组13%,50 μATsES组为14%,100μA TsES组为17%,150 μA TsES组为21%,其中150 μA TsES组与对照组相比差异有统计学意义,而150 μA TsES组与100 μA ONC组相比,差异较小,没有统计学意义。在ONC后7天时,TsES治疗组小胶质细胞活化数量相比对照组较低,差异有统计学意义。ERG结果表明延迟性TsES能够改善视神经损伤急性期视网膜的功能。其中以100 μA TsES组最为明显,1周时100 μA TsES组PhNR幅值高于对照组,差异有统计学意义,2周时100 μATsES组PhNR幅值高于其余各组,差异有统计学意义。第三:与对照组相比,延迟性ONC治疗组,在视神经损伤后1周:胶质细胞表达iba-1较对照组偏低。RGC层SOD-2和NQO-1的表达升高;视网膜RGC层、内丛状层和内核层p-AKT表达相比对照组增加;RGC层和内核层中BDNF表达相比对照组增加;视网膜RGC层、内丛状层和内核层,FGF-2表达相比对照组增加。此外,在ONC后2周,这种趋势降低。Western结果表明视神经损伤后1周视网膜p-AKT、SOD-2、bax和AIF的表达各组间差异较小,没有统计学意义。结论本研究通过SD大鼠球后视神经1.5mm处钳夹5秒建立大鼠ONC模型方法稳定可靠,适用于研究视神经损伤和神经保护机制。延迟性经巩膜外置金电极在大鼠ONC模型具有神经保护作用,其中电刺激的参数:电流强度100 μA,20Hz交流电,双相波,2.5ms/phase duration,电刺激30min,神经保护效果较好,可用于长期电刺激治疗的研究中。延迟性TsES神经保护作用主要的机制可能是上调Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化酶NQO1和SOD-2在视网膜的表达;上调PI3K/AKT信号通路中p-AKT的表达;上调视网膜神经营养因子BDNF和FGF-2的表达。