牡丹(Paeonia suffruticossa Andr.)是属于芍药科芍药属的多年生木本落叶灌木,其观赏价值与药用价值特别高,已经有4000多年的栽培历史。牡丹籽油价值比较高,近年来,因其含有丰富的不饱和脂肪酸而被广泛研究,主要包括油酸、亚油酸、棕榈酸以及亚麻酸,其不饱和酸的含量明显高于饱和脂肪酸的含量,高达83.42%,而α-亚麻酸的含量占其比率最高,大约66.8%。α-亚麻酸(ALA)属于多不饱和脂肪酸,是人体的必需脂肪酸,具有降低血糖、血脂、提高视力以及预防心肌梗塞等方面的医疗保健功能。目前关于牡丹的研究主要集中在花色上,对于其种子的形态建成及其调控牡丹籽油积累的分子机制研究还非常有限。本研究以牡丹品种’凤丹’为实验材料,测定了牡丹种子不同发育时期各项生理指标;观察了牡丹种子形态特征与内部结构变化;克隆了调控α-亚麻酸积累的关键基因PoFAD8-1的序列,并初步研究了PoFAD8-基因的特性和相关功能。主要研究结果如下:(1)采集不同发育时期牡丹种子进行各项生理指标测定:牡丹种子各项生理指标整体趋势一致,都随着种子的发育不断增加,成熟期趋于稳定,如种子重量及其贮藏物质(蛋白、淀粉、总糖含量)等生理指标,但贮藏物质在牡丹种子不同发育时期的累积速度变化不同。(2)采集不同发育时期牡丹种子进行解剖学观察:我们研究发现,随着牡丹种子的发育,种子逐渐增大,最后60d趋于稳定,长度9mm,宽度5mm左右。牡丹种子由种皮、胚、胚乳等三种结构组成,而种皮又由外种皮、中种皮、内种皮三部分组成,分别对应的是角质层、栅栏细胞层以及薄细胞层。种皮颜色是由淡黄色逐渐变成黑褐色或者黑色,在牡丹种子发育初期,只有外种皮和中种皮含有淀粉,内种皮不含有淀粉。待种子发育成熟时,淀粉全部消失。在牡丹种子发育初期,胚乳中含有少量的油体和大量的液泡,随着种子的不断发育,液泡逐渐消失,油体数量逐渐增加,待种子发育成熟时,液泡消失,油体充满整个胚乳,围绕在高电子致密物质周围。其胚乳结构变化主要表现在由网状结构逐渐形成花束状结构,最后再形成不规则的网状结构。(3)α-亚麻酸合成关键基因FAD的筛选:我们采用实时荧光定量PCR技术对FAD家族的几个基因在牡丹种子发育时期的表达模式进行检测,结果表明,FAD家族各个基因在牡丹种子不同发育时期的表达量不同,其中FAD8-1基因表达水平明显高于其它几个基因,因此,我们推测FAD8-1基因对于牡丹籽油α-亚麻酸合成起到重要作用。我们采用RACE克隆技术获得了牡丹PoFAD8-1基因全长序列,该基因全长为1625bp,完整开放阅读框1203 bp,编码400个氨基酸,其与其他植物的FAD序列均有较高的同源性。另外,我们也验证了PoFAD8-基因是内质网蛋白,而且其在核域内也有一些表达。为了进一步的研究该蛋白的功能,我们使用无细胞表达技术并成功表达以及纯化了 PoFAD8-1蛋白,蛋白分子量约为45 KD。(4)最后我们构建了含PoFAD8-1基因序列超表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法将载体转入烟草中并获得7棵抗性植株。