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三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国重要的淡水养殖经济贝类之一,近年来,由于疾病频发导致的大规模死亡事件,影响我国贝类养殖业的持续发展,造成了巨大的经济损失。Toll-样受体在识别以及清除病原微生物中起重要作用,对TLR信号通路的研究有助于我们更好地了解三角帆蚌抗菌免疫机制,为贝类的健康养殖提供理论基础。搜索三角帆蚌转录组数据库得到TLR的EST序列并设计引物,运用RACE-PCR方法获得3种Toll-样受体(以下分别简称HcTol18,9,10)的cDNA全长。结果显示:HcToll8,9,10的cDNA全长分别为2538 bp;3692 bp和2612 bp,含有2139 bp,2157 bp和2355 bp的ORF,分别预测编码712,719和784个氨基酸。生物信息学分析显示,HcTo118,9,10的蛋白质都包含一个N端信号肽,保守的结构域LRRs和TIR及一段螺旋结构的跨膜域。多序列比对表明HcToll8,9分别与虾夷扇贝(M.yessoensis),海湾扇贝(A.irradians)的同源性最高,分别为31.38%和32.65%,HcToll 10与长牡蛎(C.gigas)的同源性最高,为27.42%。经过Neighbor-Joining系统进化树分析,显示它们均与双壳类动物的Toll-样受体聚集为一枝。HcToll8,9,10在三角帆蚌血细胞、性腺、心脏、外套膜、斧足、肾、鳃、肠、肝胰腺和闭壳肌组织中均有表达。HcToll8,9主要表达于肝胰腺和鳃,血细胞中的表达量较低;HcToll10在肝胰腺中表达量最高,其次是血细胞和心脏,在鳃中表达量较低。LPS,PGN和PolyI:C刺激后,在不同时间点,HcToll8,9,10在蚌肝胰腺和鳃中的转录水平显著的上调(p<0.05),且在鳃中的转录上调明显早于肝胰腺,在72 h均恢复至正常水平。原核表达获得的重组HcTo119,10蛋白具有结合革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的能力,还能够结合LPS,PGN和PolyI:C,重组蛋白HcToll9对细菌的结合能力要高于HcToll10。制备HcToll9的多克隆抗体,分析蛋白在蚌组织中的分布,结果显示HcToll9蛋白在肝胰脏和鳃中表达量较高,在血细胞中表达量较低。亚细胞定位结果显示:HcToll-9,10融合蛋白的绿色荧光主要广泛分布在细胞质和细胞膜附近,这与它们均为跨膜蛋白是相符的。荧光素酶双报告基因实验显示HcToll9,10都可以明显激活NF-κB报告基因,表明HcToll9和HcToll10均参与了三角帆蚌的抗菌免疫应答。