论文部分内容阅读
炎症是许多生理和病理过程的基础。尽管炎症是正常的身体反应,但不受控制和误导的炎症会导致炎性疾病甚至引发癌症。对于炎症的治疗,非甾体类抗炎药（NSAIDs）像阿司匹林、布洛芬、萘普生和塞来昔布是最广泛使用的药物用来缓解疼痛,但这些药物通常具有不良副作用甚至具有致命的副作用,因此抗炎药的工业和学术研究成为焦点。项目组针对COX-2抑制剂的基本骨架特点,设计合成了一类新型的手性噻唑并吡喃酮类化合物。前期研究发现,此类化合物不仅具有显著的抗炎活性,而且在小鼠急性肝损伤及肝纤维化动物模型中有一定的疗效。为进一步探究噻唑并吡喃酮具体的作用机制,设计合成了一类噻唑并吡喃酮衍生的光交联探针。首先利用光敏的氮杂环基团能有助于化合物与其结合蛋白发生共价偶联,其次通过经典的Click反应使末端炔进行Biotin修饰作用从而利于链霉亲和素磁珠分离靶标分子,最终通过蛋白质质谱及组学分析确定其可能的靶点蛋白。利用化学生物学手段直接证明了噻唑并吡喃酮类化合物的靶点及相关的机制,验证抗炎与抗纤维化活性,并有意阐述炎症与纤维化的具体联系。基于课题组此前所发展的方法,以二氮杂环丙烯长链炔酸2c和烯基噻唑酮为底物,成功构建了手性噻唑并吡喃酮光交联探针3c,并对其进行了NMR,HPLC的表征,充分表明了3c化合物与3a化合物具有相同的手性结构。获得光交联探针3c后,通过RAW 264.7的NO抑制实验与PGE2水平释放抑制试验进行活性等效性评价,表明探针分子与母体化合物的具有相当的生物活性,用探针化合物进行靶蛋白组学进行分析。对于靶标分子的探索,首先利用Click反应进行荧光特异性标记,通过SDS-PAGE对靶标分子进行定性分析,其次通过LC-MS进行确证分析。在定性分析中RAW 264.7,HEK 293a,L02,GMC细胞系中明显发现特异性条带,且不同细胞系中的靶蛋白具有差异。在确证分析中,首先Ptgs2（COX-2）,Alox5ap（5-LOX）,Pla2g4a（cPLA2）,Lta4h（LTA4H）,Ptges3（PTGES3）,Cyp2d12（CYP450）此类靶标分子参与花生四烯酸代谢过程前列腺素和白介素的释放。其次ANXA2,ENO1,RAC1,MAPK3等靶标分子参与p38 MAPK,信号通路,一方面介导炎症反应促使炎症相关的限速酶与炎症介质的释放,另一方面经p38 MAPK通路激活核内α-SMA（ACTA2）和Collagen（COL1A1）的表达增加与ITGA/B-RHOA通路激活的各种肌动蛋白形成局灶性粘连从而导致纤维化的发生。同时CUL3,CUL5,SMURF1,RPS27A,NEDD4等相关靶标分子同时参与信号细胞内各种信号传导过程中蛋白的泛素化修饰。综上所述,本论文利用光交联基团修饰的噻唑并吡喃酮探针化合物,通过化学生物学方法对其作用的靶标分子进行了系统的蛋白组学分析。通过对不同功能的蛋白质进行网络关联分析,阐明了噻唑并吡喃酮的抗炎抗纤维化功能。这些研究有助于我们理解噻唑并吡喃酮化合物抗炎、抗纤维化的作用机制,为进一步的成药性改造修饰提供了实验基础;该研究也有助于揭示炎症与纤维化的关联机制,对此领域的新药设计、研发具有一定的指导意义。