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背景非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成为一种较为常见的肝病。它是一种无过量饮酒史,以肝细胞脂肪储积和脂肪变性为主要特征的临床病理综合征。其疾病谱随着病情的进展而表现不同,主要包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、脂肪性肝纤维化和肝硬化。其中NASH是NAFLD发病过程中由单纯性脂肪肝向肝硬化甚至肝癌进展的一个关键环节。NASH主要以脂肪浸润、肝细胞损害、炎症和纤维化为特征。近年来随着我国人民生活水平的提高,饮食结构及生活方式均出现明显改变,由此带来NASH的发病率大幅提高。同时NASH在全球的发病率也呈现上升的趋势。因此其越来越受到人们的重视。但是,NASH的发病机制至今仍未完全明确。目前较为成熟及完善的理论为―二次打击‖学说。此学说认为脂质过氧化、氧化应激及胰岛素抵抗(insuin resistance,IR)在NASH的发生和发展中起到重要作用。NASH的发病与多种因素相关,IR、氧化应激、脂质过氧化、遗传等因素均参与其发病过程。研究证实,IR常存在于NASH患者,IR是NASH的始动因素而不是结果。IR状态下,一方面产生大量的游离脂肪酸,且肝脏对脂肪酸的β-氧化作用减弱,合成极低密度脂蛋白的能力下降,导致大量脂质沉积于肝细胞。另一方面肝细胞内ATP储备减少,氧化应激反应增强,共同导致肝脏损伤的形成。而氧化应激又是引起IR的重要因素。氧化应激通过激活多种氧化还原敏感性激酶引起IR,如jun N-末端激酶(jun N-terminalkinase,JNK)通路活化可增加胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate1,IRS-1)的丝氨酸磷酸化、进而抑制胰岛素信号通路转导产生IR。Nrf2-Keap1系统在机体对抗氧化应激反应过程中具有重要作用。其中转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor2,Nrf2)是一种非常重要的转录因子,具有对抗氧化应激的作用。当受到外来氧化应激刺激时它可以与抗氧化反应元件(antioxidant-response element,ARE)相结合,从而上调Ⅱ相抗氧化酶尤其是血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)的表达对抗细胞氧化应激。研究表明,HO-1对IR具有保护作用。HO-1通过其催化产物一氧化碳(carbonmonoxide,CO)、自由铁(Fe)、胆绿素((biliverdin,BV)和胆红素(bilimbin,BR)的抗氧化、抗炎活性改善IR。既往研究证实,在高脂饮食诱导的IR大鼠模型中,诱导HO-1的表达能显著降低IR大鼠体内的氧化损伤,改善IR水平。我们前期的研究已证实姜黄素能够促进肝细胞Nrf2核转位,对肝细胞氧化应激具有保护作用。本实验利用姜黄素诱导Nrf2活化,增加Nrf2/HO-1途径的活力,通过降低氧化应激水平,观察改善IR及对NASH的保护作用。目的本实验采用高脂饮食诱导的IR大鼠模型及肝细胞LO2氧化应激模型,通过Nrf2诱导剂进行干预,观察上调Nrf2/HO-1途径对肝脏功能、病理、氧化应激及IR相关指标的影响,研究上调Nrf2/HO-1途径能否对大鼠肝脏及肝细胞LO2的IR起到保护作用,为以Nrf2/HO-1途径为靶点进行NASH的防治提供实验基础和理论依据。方法1.通过高脂饮食构建IR大鼠模型。将大鼠随机分为对照组、模型组及姜黄素干预组。对照组正常饮食,模型组及姜黄素干预组给予髙脂饮食6wk。此后对照组及模型组继续同前饮食,干预组给予髙脂饮食及姜黄素200mg/kg/d灌胃共4wk。10wk末western blot法检测Nrf2、HO-1及胰岛素信号通路的表达,生化分析仪检测肝功能,分光光度法检测氧化应激水平。2.将人肝细胞LO2分为对照组、模型组、姜黄素干预组和抑制剂组。正常培养的肝细胞为对照组;通过100U/L的GO干预2h后的肝细胞为氧化应激模型组;通过姜黄素30μM干预12h后再同模型组处理的肝细胞为姜黄素干预组;通过抑制剂wortmannin作用1h后再同干预组处理的肝细胞为抑制剂组。Western blot法观察Nrf2、HO-1及胰岛素信号通路的表达,分光光度法检测细胞氧化应激水平,速率法检测细胞培养液中AST、ALT水平。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶方法对细胞培养液中葡萄糖含量进行检测。结果1.通过髙脂饮食成功建立了IR大鼠模型。采用胰岛素-正常血糖钳夹试验表明模型组大鼠葡萄糖输注速率(GIR)显著低于对照组大鼠(P<0.01)。2.分光光度法检测各组大鼠氧化应激指标结果示:大鼠肝脏MDA水平模型组较对照组增高(P<0.01),姜黄素干预组较模型组降低(P<0.01);大鼠肝脏GSH水平模型组较对照组降低(P<0.01),姜黄素干预组较模型组显著增高(P<0.01)。生化分析仪检测肝功能指标示:大鼠血清ALT、AST水平模型组较对照组增高(P<0.01),姜黄素干预组较模型组降低(P<0.01)。3. Western blot结果显示对照组大鼠Nrf2核转位及HO-1表达较少,模型组其表达较对照组增加,姜黄素干预组Nrf2核转位及HO-1表达较对照组及模型组均明显增加;大鼠肝脏中p-JNK表达水平模型组较对照组增加,姜黄素干预组较模型组减少;JNK表达水平各组间未见明显变化;大鼠肝脏中p-IRS-1水平的表达模型组较对照组减少,姜黄素干预组较模型组增加;IRS-1表达水平各组间未见明显变化。4.人肝细胞LO2中ALT、AST及MDA水平模型组均较对照组增高(P<0.01),姜黄素干预组较模型组降低(P<0.01),抑制剂组较干预组增高(P<0.01);GSH水平模型组较对照组降低(P<0.01),姜黄素干预组较模型组增高(P<0.01),抑制剂组较干预组降低(P<0.01)。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶方法检测细胞培养液中葡萄糖含量结果示:模型组较对照组增高(P<0.01),姜黄素干预组较模型组降低(P<0.01),抑制剂组较干预组增高(P<0.01)。5. Western blot结果显示肝细胞Nrf2核转位及HO-1的表达模型组较对照组轻度增加,姜黄素干预组较模型组明显增加,抑制剂组较干预组减少;模型组肝细胞中p-JNK表达水平较对照组增加,姜黄素干预组较模型组减少,抑制剂组介于模型组和干预组之间;JNK表达水平各组间未见明显变化;模型组肝细胞中p-IRS-1表达水平较对照组减少,姜黄素干预组较模型组增加,抑制剂组介于模型组和干预组之间;IRS-1表达水平各组间未见明显变化。结论本实验通过观察Nrf2诱导剂姜黄素对高脂饮食诱导的大鼠IR模型的影响,发现诱导Nrf2核转位能够上调肝脏HO-1的表达,进而改善高脂饮食引起的肝功损害、氧化应激及IR。并利用肝细胞氧化应激模型,通过诱导或阻断Nrf2核转位,发现阻断Nrf2核转位后,部分逆转了诱导其核转位时改善肝细胞功能及胰岛素抵抗的效应,证实诱导Nrf2/HO-1途径能够降低氧化应激导致的IR,其效应可能是通过降低JNK磷酸化水平、增加IRS-1磷酸化水平,进而改善胰岛素信号通路。为以Nrf2/HO-1途径为靶点干预NASH提供新的实验基础和理论依据。