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哺乳动物的嗅觉器官能识别和区分千万种结构上有差异的挥发性化学物质。这种化学感应功能是由一个非常庞大的嗅觉受体家族所完成的,它们主要在鼻上皮细胞嗅觉神经元表面表达。嗅觉受体属于G-蛋白偶联受体(GPCRs)超家族A类,由一个包含1,000个基因的家族——嗅觉受体基因家族编码,嗅觉受体基因在基因组上成簇分布,且任何一个给定的嗅觉受体神经元中只表达一个等位基因。
除了在嗅觉上皮中有表达的嗅觉受体外,其他如睾丸、心脏、前列腺、erythroid细胞中,也曾发现过类似嗅觉受体。但这些受体的功能未知。
本研究利用cDNA微阵列技术,比较了6种人正常组织及3对肝癌/正常肝组织标本基因表达的差异,发现了一个肝脏特异的基因FF456。12个组织Northern杂交和24个组织半定量RT-PCR的结果也证明了FF456在肝脏中表达的高度特异性。3对肝癌组织的芯片结果和12对肝癌标本半定量RT-PCR结果表明;与正常肝组织比较,FF456在肝癌中表达剧烈下调。我们采用RACE技术得到了一个长度为1757bp的FF456基因的cDNA克隆。经测序和数据库检索显示,FF456是个未知基因,染色体定位于1q23,由1个外显子组成,开放阅读框831bp,编码276个氨基酸。同源性比对发现,该基因与嗅觉受体具有高度的同源性。从FF456基因的高度组织特异性及其GPCR家族特点来看,符合经典嗅觉受体的普遍特征。我们将ORF克隆入pEGFPN1载体,构建了pEGFPN1-FF456重组质粒,转染L02细胞,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察结果表明,FF456-EGFP融合蛋白主要定位在细胞膜上。
分析FF456基因上游序列发现,该基因上游集中了很多重要的顺式作用元件的特征序列。我们分别将正常肝、肝癌和癌旁组织基因组DNA中FF456基因转录起始位点的上游序列克隆入pGL3Basic质粒,构建一系列5端缺失的重组质粒,利用高灵敏度的荧光素酶报告基因,检测它们在L02细胞中的瞬时表达情况。发现FF456基因转录起始位点上游501bp内就已经具备了基础启动子活性,提示在TSS上游2000bp-1000bp中可能存在重要的转录因子结合位点。
本研究的主要结果是:1.克隆了人的在肝脏中特异表达的FF456基因,该基因类似嗅觉受体基因。2.研究发现FF456基因在肝癌组织中表达下调,其表达产物主要分布在细胞膜上。3.初步鉴定了FF456基因的启动子区域并预测了转录因子结合位点。