肺癌是全世界最常见也最致命的肺原发性恶性肿瘤,近年来其死亡率高居恶性肿瘤首位。由于肺部感觉神经不发达,早中期肺癌常无任何症状,临床上约85%的患者在确诊时已到肺癌晚期,此时大部分患者已经失去手术机会,故主要以放、化疗和分子靶向治疗为主。据统计,非小细胞肺癌（NSCLC）患者的5年生存率仅为10%～15%,小细胞肺癌（SCLC）则仅为5%,并且由于放、化疗所产生的肝、肾毒性、耳毒性和免疫力下降等限制了药物的使用,患者生存质量较低。中西药协同治疗使肺癌患者在改善症状,提高生活质量、延长生存期上面具有明显的效果。顺式-二氯二氨合铂（Cisplatin,DDP）简称顺铂,是周期非特异性抗肿瘤药物,目前临床上常用的广谱抗癌药之一,用于多种肿瘤的一线化疗药。但顺铂在抗肿瘤作用的同时,易对机体的骨髓、消化系统、肾脏和内耳等产生毒副作用,并且长期或者大剂量使用容易造成顺铂耐药,使其疗效下降。参芪扶正注射液是主要用于扶正补气、辅助抗癌的纯中药静脉型大输液,其主要原料为党参、黄芪,含有多糖、皂苷、木脂素、黄酮等化学成分,属国家二类中药新药。党参皂苷可增强免疫细胞功能,改善食欲,减轻疲乏,并可一定程度地改善植物神经功能;党参多糖具备加强体液免疫,阻碍肿瘤细胞继续发展,抗肿瘤细胞转移的功效。黄芪中的黄芪多糖和黄芪皂苷类成分,可以加强免疫细胞活性。文献报道参芪扶正注射液临床上主要通过提高患者免疫力、改善生活质量用于辅助治疗肺癌、胃癌等。中西药联用增效治疗疾病应用越来越多,但顺铂和参芪扶正联用增效及其作用机制报道较少。基于此,本文首先通过网络药理分析构建顺铂、参芪扶正和肺癌分子相关网络靶点,对这些靶点进行进一步文献研究后,拟选取它们作为后续动物及细胞实验的指标。然后将顺铂和参芪扶正单药以及二者联用作用于A549/LLC细胞探究二者联用是否能够有效增强抗肺癌作用,并通过网络药理学结果选取相关作用靶点利用免疫蛋白印迹法（Western Blot）探究二者联用增效潜在作用机制,最后通过动物实验进行药效学验证。具体研究内容如下:1参芪扶正协同顺铂抗肺癌分子网络构建首先将顺铂和参芪扶正注射液主要成分:5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural）、丁香苷（Syringin）、黄芪甲苷（AstragalosideⅣ）、黄芪甲苷1（Astragaloside Ⅰ）、黄芪甲苷 2（AstragalosideⅡ）、黄芪甲苷 3（Astragaloside Ⅲ）、芒柄花素（Formononetin）、毛蕊异黄酮（Calycosin）、鸟苷（Vernine）、松柏苷（Coniferin）、香草酸（Vanillic acid）、党参炔苷（Lobetyolin）设置为关键词通过 Genecards（http://www.genecards.org/）数据库检索与药物相关的基因。以“homo sapiens”为背景,提取Genecards数据库中信度较高（score＞3.0）的相关基因靶点,并进行去重、统一名称等处理,其中顺铂共得到451个靶点,参芪扶正注射液有255个靶点。将非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer）提交到DisGeNET数据库,以人类基因为背景,提取数据库中信度较高（score＞2.0）的相关基因靶点,并进行去重、统一名称等处理,共获取非小细胞肺癌相关基因3940个。将顺铂、参芪扶正与肺癌的相关基因靶点使用Cytoscape3.7.0软件进行映射,得到药物/成分-靶点-疾病网络图,共计69个联用靶点,其中同时与顺铂（score＞12.0）和非小细胞肺癌（score＞54.0）可信度较高的有9个。将确定的药物/成分-靶点-疾病网络导入Cytoscape软件的ClueGO插件中进行KEGG通路富集分析,所得的KEGG通路结果导入KEGG（http://www.kegg.jp）网站进行通路查询,将通路结果与参芪扶正、顺铂和非小细胞肺癌药物/成分-靶点-疾病网络相结合,确定了 CASP3、CASP9、BAX、BCL-2、JAK2、STAT3、P50、P65和VEGF作为参芪扶正和顺铂联用抗肺癌的体外和体内实验的指标。2参芪扶正注射液联用顺铂对A549/LLC细胞增殖以及A549细胞形态、凋亡作用和机制研究首先,将不同浓度的参芪扶正注射液（0.01 mL/L、0.1 mL/L和1 mL/L）和顺铂（0.001μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1μg/mL、5μg/mL）分别单独及联合作用于 A549 和LLC细胞,用MTT 比色法来评价药物对肺癌细胞生长抑制作用。结果表明各个浓度的参芪扶正注射液单独作用于A549细胞和LLC细胞后无明显抑制作用（P＞0.05）;顺铂单用后肺癌细胞的生长受到抑制,浓度越高,抑制作用越显著,抑制作用具有浓度相关性;参芪扶正和顺铂联用后与各浓度顺铂单用组相比,联用组均能增加细胞抑制率,结合联用指数后发现0.01 mL/L参芪扶正注射液与顺铂联用效果最佳,协同作用更加显著（P＜0.05）。顺铂和参芪扶正作用于A549细胞24 h后,用DIL和DAPI对A549细胞进行染色,DIL会将细胞膜染成红色,DAPI将细胞核染成蓝色,在激光共聚焦显微镜下观察细胞,可以发现相较于空白组,参芪扶正注射液组细胞核和细胞膜没有明显变化,但顺铂组细胞核虽完整,但细胞膜有破损、变形的现象,并且联用参芪扶正注射液后,细胞膜破损变形更加严重,说明两药联用产生了协同作用。将A549细胞用顺铂和参芪扶正分别单独及联合作用24 h后,Annexin V-FITC和PI双染细胞用流式细胞仪检测可以分辨出凋亡细胞和正常细胞,从而得到药物对细胞凋亡的影响。由实验结果可知,参芪扶正注射液单独给药后对A549细胞凋亡无显著影响（P＞0.05）;顺铂单用后对A549细胞凋亡具有促进作用,顺铂浓度越高,促凋亡作用越显著（P＜0.05）,具有浓度相关性;顺铂各浓度联用参芪扶正注射液后,促凋亡作用均有所增加,参芪扶正注射液和顺铂联用表现出显著的协同作用。根据网络药理学分析结果以及细胞增殖、凋亡实验结果,我们采用Western Blot进一步验证二者联用潜在的协同抗肺癌作用机制,研究结果表明参芪扶正和顺铂联用均可显著上调 Caspase-3、Caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白的表达（P＜0.01）,同时抑制 JAK2、STAT3、P65和P50蛋白的表达（P＜0.01）,发挥协同作用。由此我们可以推测参芪扶正和顺铂联用增强顺铂抗肺癌的作用机制可能与增强Caspase-3、Caspase-9、Bax/Bcl-2蛋白的表达以及抑制JAK-STAT和NF-kB通路有关。3参芪扶正注射液协同顺铂对C57BL/6小鼠皮下肺癌模型的药效学研究通过体外细胞实验我们发现参芪扶正注射液联用顺铂后可以增强抗肺癌的作用。本节利用荷瘤动物模型进一步探究二者联用抗肺癌的作用。首先建立背部皮下肺癌模型,将小鼠随机分为4组,正常组,模型组、顺铂单用组以及参芪扶正和顺铂联用组。造模7天后给药,正常组和模型组均给生理盐水（10 mL/kg·d）;顺铂组给药2 mg/kg·d,连续给药5天;联用组同时给药顺铂2 mg/kg·d（连续给药5天后停止给药）和参芪扶正10mL/kg,参芪扶正注射液连续给药17天,17天后取材。评价指标包括瘤重及抑瘤率,脾脏/胸腺指数、免疫因子IL-2和肿瘤免疫组化组织切片凋亡蛋白表达量。由瘤重及抑瘤率可以得出,顺铂组瘤重相比模型组有所降低,顺铂联用参芪扶正后能够抑制肿瘤的进一步生长,说明参芪扶正可以增强顺铂疗效。从脾脏/胸腺指数以及免疫蛋白因子IL-2含量可以看出联用顺铂可以增强荷瘤小鼠的免疫能力。免疫组化结果表明联用组肿瘤组织切片中的凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2/Bax表达增加,血管内皮生长因子VEGF表达量下降,说明参芪扶正注射液和顺铂联用具有协同抗肺癌作用。参芪扶正联用顺铂一方面提高了荷瘤小鼠的免疫能力发挥抗肿瘤的作用,另一方面也促进了肿瘤组织中凋亡蛋白的表达、抑制肿瘤的生长。参芪扶正和顺铂联用具有协同抗肺癌作用。