研究背景：颅内动脉瘤(Intracranial aneurysm, ICA)是指脑内动脉管壁的薄弱导致局限性囊性扩张,是引起自发性蛛网膜下腔出血的最常见原因。传统上颅内动脉瘤的发现多是由于动脉瘤破裂导致的蛛网膜下腔出血,其病程隐匿,起病突然,一旦破裂出血,其病死率高达25%～40%,致残率约33%,再破裂出血病死率则高达40%～75%,严重威胁着人类的健康。因此,颅内动脉瘤诊断一旦明确,应引起足够重视,针对破裂风险大的患者应积极手术干预,其目的是预防动脉瘤破裂出血。目前,动脉瘤的治疗主要有显微手术夹闭和血管内介入治疗两种方式,且就开颅手术所造成的脑组织损伤而言,血管内介入栓塞治疗优于显微手术夹闭。血管内介入栓塞治疗动脉瘤使破裂动脉瘤的死亡率显著降低,且患者依从性好,使绝对危险度下降7.4%,导致癫痫发作的几率降低。但目前临床上常用的弹簧圈缺乏生物活性,栓塞术后动脉瘤颈处内皮覆盖不全,可能导致动脉瘤残留或复发。为解决此问题,除寻找新的材料或设计各种复杂形状弹簧圈外,对铂金微弹簧圈的生物功能化可起到事半功倍的效果。自意大利学者Guglielmi(1989年)设计出电解可脱性微弹簧圈(Guglielmi detachable coil, GDC)以来,采用铂金微弹簧圈经动脉介入栓塞治疗动脉瘤的技术,以创伤小、恢复快、痛苦小、并发症少等优点,逐渐成为大型医疗机构治疗颅内动脉瘤的首选方案。弹簧圈应用于血管内栓塞治疗动脉瘤的机理主要是通过铂金微弹簧圈的机械性填塞,闭塞瘤腔,改变局部血流动力学因素,从而消除动脉瘤破裂出血的风险。然而,标准铂金GDC存在生物学惰性,动脉瘤栓塞术后不易诱发血栓和机化,持续的动脉搏动导致弹簧圈压缩而再通。因此,与传统的开颅夹闭手术相比,血管内治疗动脉瘤仍存在较高的复发率。在国际上一些大规模的临床研究中,通过数字减影血管造影(Digital subtration angiography, DSA)随访发现,采用铂金微弹簧圈栓塞治疗动脉瘤的复发率超过20%,部分病人尚发生中、远期再次破裂出血。为弥补目前GDC存在的不足,加速动脉瘤腔的纤维化和瘤颈部位的内皮覆盖,如在利用生物可吸收的聚合物涂层弹簧圈基础上负载某些细胞活化因子,使其在动脉瘤内随聚合物材料的降解而控制释放、缓慢表达,提高微弹簧圈的生物活性作用,则有利于动脉瘤栓塞术后愈合过程,减少复发和再出血风险。最近几年有研究表明：趋化因子在参与保护宿主、清除致病因子、炎性反应及免疫系统自稳等方面起作用,并且在心脑血管系统的发育以及损伤的修复等方面都发挥重要的作用。趋化因子即一类具有趋化作用,能够趋化调节细胞迁移的细胞因子,而其受体则是介导趋化因子行使其生物学功能的GTP蛋白耦联的跨膜受体,通常免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上有所表达。基质细胞衍生因子(Stromal cell-derived factor-la, SDF-1α)是一种具有趋化活性的因子,其为CXC亚家族成员,CXCR4为其受体,SDF-la能够通过与细胞表面受体CXCR4特异性结合发挥作用。已有大量研究表明,SDF-1α及其受体在中枢神经系统的发育过程中参与调节多种神经细胞的迁移。近期有研究表明,较原始的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)能够表达SDF-1α的受体CXCR4,因此,SDF-la可趋化EPCs,促进EPCs迁移、归巢,并在局部分化为内皮细胞。血管内皮祖细胞(EPCs)是一种可增殖、分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞,生理情况下它主要参与血管的动态维持和重建。但在病理条件下,机体自身的代偿难以产生足够的修复能力,尤其是存在缺血性心脑血管疾病危险因素的患者,其EPCs的数量及生物学功能均显著下降。研究证明EPCs的数量与Framingham心血管危险系指数呈负相关。这提示在体外富集、扩增EPCs再自体移植以促进血管修复或再生是一个积极有效的策略,EPCs也可以作为一种良好的种子细胞来源应用于组织工程重建血管结构。动员和移植EPCs可提高缺血组织的血管增生能力,促进血管的修复和再内皮化。以EPCs移植治疗各种血管性损伤模型,如脑缺血、肢体缺血、心肌梗塞、颈动脉内膜剥脱等,已有了较多的报道。本研究旨在构建一种负载SDF-1α的新型生物活性弹簧圈,在体内能够缓释SDF-1α,当涂层弹簧圈填塞大鼠动脉瘤模型后,能够促进EPCs迁移、归巢,促进动脉瘤内皮增殖、瘤腔纤维化以及瘤颈部位的内皮覆盖,从而降低动脉瘤栓塞后复发率。如何将SDF-la固定于铂金微弹簧圈材料表面,并达到缓慢控制释放也是本研究内容之一。丝蛋白(Silk fibroin, SF)作为一种来源自然界、具有良好生物相容性、可降解性等优点的生物材料,常用于组织工程研究。丝蛋白具有被诱导发生β晶型转变的特性,使其在水溶液中的溶解性能发生改变,由可溶变为不可溶。利用丝蛋白的这一特性,将丝蛋白作为SDF-1α的传输体系,固定SDF-1α于铂金微弹簧圈表面,通过丝蛋白溶解性能的改变,实现缓释SDF-1α的目的。综上所述,利用具有良好生物相容性、可吸收的丝蛋白涂覆铂金微弹簧圈,实现SDF-1α的有效负载,使其在动脉瘤栓塞术后随着丝蛋白的吸收而实现SDF-1α的控释、缓释,其通过SDF-1特异性受体CXCR4能够促进EPCs迁移、归巢,促进动脉瘤内皮增殖、瘤腔纤维化以及瘤颈部位的内皮覆盖,从而降低动脉瘤栓塞后复发率,利于动脉瘤栓塞术后达到解剖学愈合,减少复发和再次破裂出血风险。第一部分构建负载SDF-1α的生物活性弹簧圈,及其结构表征、性能检测研究目的：构建负载SDF-1α的新型生物活性弹簧圈,检测弹簧圈的表面形貌及其缓慢释放SDF-1α的性能,为研究负载SDF-1α弹簧圈趋化EPCs从而促进动脉瘤颈愈合奠定基础。研究方法：将切割长度约8mm的弹簧圈超纯水清洗过后用油泵抽干备用。将10μg的SDF-1α溶解于5001μ1的3%(m/v)的丝蛋白溶液中；将干燥好的弹簧圈浸泡于上述溶液中,制备负载SDF-la弹簧圈。使用扫描电子显微镜(SEM)检测处理前弹簧圈及处理后弹簧圈的表面形貌,利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测负载SDF-la弹簧圈的缓释性能。研究结果：SEM结果显示处理后弹簧圈表面均匀涂覆聚合物,与处理器弹簧圈比较,形态无明显改变。负载SDF-la弹簧圈的体外SDF-la释放量在测试周期内呈现明显的积累递增趋势。研究结论：实现了SF/SDF-1α在弹簧圈表面的均匀涂覆和SDF-la体外释放可控,成功制备负载SDF-la的生物活性弹簧圈。第二部分EPCs的分选、培养、鉴定及负载SDF-1α弹簧圈促进EPCs的迁移研究目的：从大鼠骨髓中原代分离、培养和鉴定EPCs,为研究涂层弹簧圈对EPCs趋化影响动脉瘤颈的愈合奠定基础,并通过体外实验验证涂层弹簧圈有促进EPCs迁移的作用。研究方法：获取重量为100g左右的雄性SD大鼠骨髓,使用Ficoll-PaqueTM淋巴细胞分离液收集分离的单个核细胞,使用EGM-2MV内皮细胞增殖培养基诱导分化EPCs,并对其进行形态学观察；利用流式细胞仪检测CD133、CD34、 VEGFR-2的阳性表达率,利用体外毛细血管管腔结构形成实验检测EPCs的管腔形成能力,利用Transwell迁移实验观察负载SDF-1α弹簧圈对EPCs迁移的影响。研究结果：培养24～48h后,单个核细胞开始出现贴壁,3～7d后呈现典型梭形细胞形态,在细胞培养至7～14d时,逐渐出现"Cord-like structures"及"Network formation"结构,而在细胞培养至28d时,呈典型铺路石样改变。流式细胞仪分析提示细胞表面标志CD133、CD34以及血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)分别为：66.38%、88.87%、82.69%。体外毛细血管管腔形成实验显示,EPCs有较强的管腔形成能力。Transwell迁移试验统计学结果显示,与空白组相比,负载SDF-la弹簧圈可以有效促进EPCs的迁移。研究结论：通过密度梯度离心法从骨髓分离单个核细胞,再用含VEGF、bFGF等因子EGM-2MV内皮细胞增殖培养基诱导培养,利用体外毛细血管管腔形成实验及流式细胞仪以VEGFR-2、CD133及CD34为标志物对纯化细胞进行检测,可获得较为纯化的EPCs,体外Transwell迁移试验显示负载SDF-la弹簧圈对EPCs迁移有促进作用。第三部分负载SDF-1α弹簧圈趋化移植EPCs促进大鼠动脉瘤腔纤维化及瘤颈的内皮覆盖研究目的：建立大鼠动脉瘤模型,追踪移植细胞与负载SDF-la弹簧圈关系,验证负载SDF-la弹簧圈对大鼠动脉瘤的修复作用及动脉瘤颈愈合作用。研究方法：60只雄性SD大鼠随机分为单纯手术组、裸圈栓塞组、裸圈栓塞+EPCs移植组、负载SDF-1α弹簧圈栓塞组、负载SDF-1α弹簧圈栓塞+EPCs移植组。根据分组在右侧颈总动脉分别植入不同类型弹簧圈,并在术后通过尾静脉注入EPCs细胞悬液。根据分组分别在术后14d、28d对大鼠麻醉,并灌注固定,取动脉瘤部位血管组织,利用普通光学显微镜观察动脉瘤颈部位大体形态；应用HE染色、Van Geson染色和Verhoeff’s染色、免疫荧光染色对动脉瘤组织进行病理学检测；利用荧光显微镜技术检测体外培养的EPCs在弹簧圈附着情况；利用扫描电镜检测弹簧圈标本表面细胞贴附情况。研究结果：实验结果显示负载SDF-1α弹簧圈栓塞+EPCs移植组的动脉瘤颈为新生内膜所覆盖,动脉瘤颈部分愈合,内膜表面粗糙14、28d时负载SDF-la弹簧圈联合EPCs移植组的动脉瘤颈愈合情况明显优于其他分组(P<0.05)。扫描电镜下检测结果显示14d时负载SDF-1α弹簧圈栓塞HEPCs移植组的弹簧圈标本表面的细胞数量明显多于单纯负载SDF-1α弹簧圈栓塞组和其他组；28d时负载SDF-lα弹簧圈栓塞+EPCs移植组及单纯负载SDF-1α弹簧圈栓塞组的弹簧圈标本表面可见纤维膜覆盖弹簧圈,其他三组仅有少量细胞团覆盖。HE染色、VanGeson染色和Verhoeff’s染色、免疫荧光染色对动脉瘤组织进行病理检查提示负载SDF-la弹簧圈栓塞+EPCs移植能够促进动脉瘤壁内皮增殖和瘤腔纤维化,可更好地达到闭塞动脉瘤腔的目的。研究结论：负载SDF-1α弹簧圈在体内能够有效趋化EPCs,促进动脉瘤内皮增殖、瘤腔纤维化,促进动脉瘤颈的内皮覆盖,为促进动脉瘤愈合、降低动脉瘤复发率提供了一种新的思路和方法。