背景和目的:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一组以持续性气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病。COPD气流受限的特征通常呈现进行性发展,伴随着呼吸道和肺脏对有毒颗粒、有害气体的慢性炎性反应增强。因为对COPD的病因和发病机制缺乏更深的研究,新的治疗手段极其有限。新近研究指出,COPD的病程与免疫调节息息相关,该病的发生、发展直接与气道上皮的损伤与修复有着密切的关系。气道上皮是肺的第一道防线,是呼吸系统防御外界环境侵害的保护屏障。气道上皮细胞凋亡的增加可使气道上皮基底层裸露,增大基底层和有毒炎性介质的接触范围,造成炎症扩散和气道重塑。淋巴细胞微粒(lymphocyte-derived microparticles,LMPs)是当淋巴细胞损伤、凋亡或激活后,从胞膜上出芽脱落,形成的小囊泡颗粒。本课题组前期临床研究发现,LMPs在COPD患者的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中呈病理性升高,与疾病的严重程度密切相关。进一步动物实验研究证实LMPs可诱导C57BL/6小鼠的气道炎症[1]。据此,我们推测LMPs在COPD发生、发展过程中起着重要作用,其始动靶点可能是作用于气道上皮细胞。氧化应激与细胞凋亡密切相关,氧化应激过程中产生的大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)通过脂质过氧化反应,对膜磷脂内的脂肪酸进行修饰,从而改变了膜蛋白结构、质膜物理流动性、及细胞内的信号转导通路等等,最终引起细胞凋亡或坏死。花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是人体必需脂肪酸之一,属于Omega-6系列的长链多不饱和脂肪酸。它广泛存在于动物体内细胞,是构成细胞膜成分的重要物质。AA与氧化应激两者之间的相互关系非常复杂,且和细胞的种类有关,它们共同作用导致组织细胞损伤。有文献报道LMPs可刺激脐静脉内皮细胞发生氧化应激,但氧化应激是否在LMPs介导气道上皮损伤过程中扮演着重要的角色有待证实。LMPs作为一种有细胞活性的碎片,其表面携带亲代淋巴细胞特有的抗原,内部包含膜脂质成分、受体、多种细胞因子、酶类、核酸等多种物质。LMPs可通过受体和黏附分子与靶细胞建立特殊的交互作用,向靶细胞传递多种物质,如细胞器、受体和其它蛋白,并可介导靶细胞分泌多种细胞因子。LMPs还可促进细胞与细胞相互作用,作为信使来传递生物学相关信息。目前,LMPs中何种成分可对气道上皮细胞发挥毒性作用尚不清楚。本研究拟探讨LMPs对气道上皮细胞的作用及其可能机制,并阐明LMPs对气道上皮细胞发挥作用的关键成分。方法:1.LMPs对气道上皮细胞作用的研究1.1 LMPs的提取和鉴定人CEM-T淋巴细胞购自中国科学院北京细胞库。取生长良好、形态正常的CEM-T细胞,加入终浓度为5μg/ml的细胞松弛素D(actinomycin D)刺激24 h后,取培养上清按照国际公认的多重梯度离心法提取LMPs。最后一次离心后的上清液作为对照。流式细胞仪分析技术鉴定LMPs的大小和annexin V阳性率。Bradford蛋白浓度测定法测定LMPs的浓度。10μM Di I预染CEM-T淋巴细胞20 min,再加入细胞松弛素D刺激细胞24h,即可到Dil-LMPs。1.2 LMPs对人气道上皮细胞的作用1.2.1细胞形态学观察LMPs诱导前后,普通光学显微镜和透射电镜观察气道上皮细胞形态学方面的变化。1.2.2细胞生长和增殖检测MTT检测低浓度LMPs(1μg/ml和2μg/ml)或高浓度LMPs(5-40μg/ml)对气道上皮细胞生长的影响。分析20μg/ml LMPs刺激下细胞生长率与刺激时间(24 h、48 h或72 h)的关系。LMPs刺激细胞不同时间(24 h、48 h或72 h),Ki67免疫荧光染色检测细胞增殖的变化及其与刺激时间的关系。1.2.3凋亡检测通过Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪分析技术分析不同刺激浓度(10μg/ml和20μg/ml LMPs),或不同刺激时间(24 h和48 h)下细胞的凋亡。caspase抑制剂Z-VAD-FMK(50μM)预处理气道上皮细胞后再加入LMPs共培养来分析抑制caspase后对细胞凋亡的影响。1.2.4免疫荧光染色检测LMPs和细胞的作用方式选取人支气管上皮16HBE细胞和肺泡上皮A549细胞进行研究:给予细胞不同浓度的Dil-LMPs(5,10,20μg/ml)的刺激,或给予不同的刺激时间(30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和16 h)后,荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察细胞内Dil-LMPs的内化情况和溶酶体的共定位情况。分析LMPs内化情况与刺激时间或刺激浓度的关系。使用20μM的吞噬抑制剂细胞松弛素D或20μg/ml的溶酶体抑制剂氯喹预处理16HBE细胞后再加入LMPs共培养来分析Dil-LMPs与细胞的作用方式。1.3 LMPs对小鼠气道上皮和肺上皮的作用1.3.1组织病理学观察将实验动物C57BL/6随机分为2组(n=6):对照组和LMPs处理组。手术获取各组小鼠的支气管环和肺组织块进行体外培养,按分组给予不同的处理。扫描电镜观察支气管上皮形态学变化。HE染色对支气管和肺组织行组织病理学检测。1.3.2 TUNNEL原位末端凋亡检测LMPs诱导体外培养的鼠支气管环和肺组织块24 h,TUNNEL原位末端凋亡检测细胞凋亡。2.LMPs诱导气道上皮细胞凋亡的作用机制研究2.1 LMPs对气道上皮细胞caspase的影响2.1.1 caspase检测(1)酶活性检测试剂盒检测LMPs诱导前后,气道上皮细胞内caspase-3、-8和-9酶活性的变化。再通过Western blot检测caspase-3和cleaved caspase-3蛋白的变化进一步证实。(2)caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理16HBE和A549细胞后再加入LMPs共培养来分析抑制caspase后对细胞凋亡的影响。2.2 LMPs对气道上皮细胞氧化应激的影响2.2.1 MDA、超氧化物、ROS和GSH的检测使用相应的检测试剂盒测定LMPs刺激16HBE和A549两种细胞不同时间前后细胞内关键的氧化产物MDA、超氧化物、ROS和抗氧化产物GSH的含量的变化。2.2.2凋亡分析20μM的抗氧化剂NAC预处理16HBE和A549细胞后再加入LMPs共培养来分析抑制氧化应激后对细胞凋亡的影响。2.3 LMPs对气道上皮细胞氧化应激上下游机制的影响2.3.1 Western blot检测MAPK家族蛋白的变化Western blot检测MAPK家族的三个成员p38 MAPK、JNK和ERK主要蛋白:p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白和caspase-3、cleaved caspase-3蛋白的变化。2.3.2 ELISA检测AA含量的变化(1)ELISA检测LMPs内AA的含量和LMPs诱导前后气道上皮细胞内和培养上清中总AA含量的变化。(2)20μM细胞松弛素D预处理16HBE和A549细胞后再加入LMPs共培养来分析对细胞产生AA的影响。2.3.3 AA对细胞凋亡的影响流式细胞仪分析技术分析100μM AA刺激前后气道上皮细胞内DNA的含量变化。同时对细胞内caspase-3酶活性进行检测。两种方法共同分析AA对细胞凋亡的影响。2.3.4 p38 MAPK信号传导通路对AA和ROS的影响(1)1μM的p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580预处理16HBE和A549细胞后再加入LMPs共培养,ELISA检测细胞总AA含量的变化。(2)1μM的p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580预处理16HBE和A549细胞后再加入LMPs共培养,流式细胞仪分析技术分析细胞内ROS的含量变化。2.3.5 AA对ROS的影响10μM AA的抑制剂TFP预处理16HBE和A549细胞后再加入LMPs共培养,流式细胞仪分析技术分析ROS的含量变化。2.3.6 AA对caspase-3的影响10μM AA的抑制剂TFP预处理细胞和LMPs继续刺激后,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。Western Blot检测caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表达情况。使用10μM TFP单独诱导细胞相同时间观察TFP本身对细胞凋亡的影响。3.LMPs对气道上皮细胞发挥促凋亡作用的关键成分3.1使用PSR抗体中和气道上皮细胞表面抗原PSR,免疫荧光染色检测Dil-LMPs内化入气道上皮细胞的变化情况。3.2 Western blot检测LMPs上Fas L的表达。使用Fas L抗体中和LMPs上的Fas L蛋白后,MTT检测对气道上皮细胞生长的影响。3.3高温灭活LMPs后,MTT检测对气道上皮细胞生长的影响。结果：1.1 LMPs的提取和鉴定结果细胞松弛素D诱导后成功获得LMPs,流式细胞仪检测技术显示LMPs直径小于1μm,annexin V阳性率是75.73%,符合MPs的特性。1.2 LMPs对人气道上皮细胞的作用1.2.1细胞形态学观察结果光学显微镜和透射电镜均可观察到LMPs导致的细胞形态学的改变。如细胞发生皱缩、出现髓样结构、空泡形成、胞核深染、染色体浓缩和胞膜结构改变,甚至凋亡小体形成、细胞发生坏死。1.2.2细胞生长和增殖检测结果(1)低浓度的LMPs(1μg/ml和2μg/ml)不影响细胞生长(p>0.05)。浓度为5-40μg/ml时抑制细胞生长(p都<0.001)。细胞生长抑制率随着LMPs浓度的增加和刺激时间的延长逐渐加大。提示LMPs抑制细胞生长具有浓度依赖性和时间依赖性。(2)Ki-67染色显示LMPs可使细胞的增殖率从对照组的60%下降到39.1%(24 h)、12.6%(48 h)或3.3%(72 h)。提示LMPs抑制细胞增殖具有时间依赖性。1.2.3凋亡检测结果Annexin V和PI双染结果显示LMPs刺激后,Annexin V的单阳性率,Annexin V+PI双阳性率和Annexin V总阳性率均明显增高。且LMPs在20μg/ml时作用明显,已有明显的促凋亡作用。1.2.4免疫荧光染色检测LMPs和细胞的作用方式(1)随着孵育时间的延长,细胞胞浆内Dil-LMPs的量逐渐增加,孵育16 h后Dil-LMPs几乎完全进入胞浆,提示LMPs进入细胞具有时间依赖性。随着Dil-LMPs浓度的增加(5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml),进入细胞胞浆内Dil-LMPs的量逐渐增加,表明LMPs进入细胞也具有浓度依赖性。(2)吞噬抑制剂细胞松弛素D处理细胞后,进入细胞胞浆的Dil-LMPs大大减少。溶酶体抑制剂氯喹处理细胞使胞浆内的聚集Dil-LMPs增多。这从正反两方面说明LMPs进入细胞的方式是通过细胞的吞噬作用实现的。1.3 LMPs对小鼠气道上皮和肺上皮的作用1.3.1组织病理学观察和TUNNEL原位末端凋亡检测结果扫描电镜、HE染色和TUNNEL染色检测LMPs诱导的体外培养的支气管和肺组织,发现LMPs使支气管上皮和肺泡上皮损伤,组织排列紊乱、细胞发生凋亡(TUNNEL染色呈棕色)。从组织培养和不同种属来源角度证实了LMPs诱导气道上皮细胞凋亡具结果:1.LMPs对气道上皮细胞作用的研究有普遍性,与细胞的种属无关。2.LMPs诱导气道上皮细胞凋亡的作用机制研究2.1 LMPs对气道上皮细胞caspase的影响(1)LMPs刺激4h时,气道上皮细胞内caspase-8和-9酶活性达到峰值(与对照组比,p<0.05);刺激8 h时,caspase-3酶活性达到峰值(与对照组比,p<0.05)。Western blot结果进一步证实LMPs使细胞内caspase-3蛋白表达增加(与对照组比,p<0.05)。(2)caspase抑制剂Z-VAD-FMK逆转LMPs介导的细胞凋亡的增加(与LMPs组比,p<0.05)。故caspase-3参与了LMPs诱导凋亡的机制。2.2 LMPs对气道上皮细胞氧化应激的影响2.2.1 MDA、超氧化物、ROS和GSH的检测结果LMPs均可增加16HBE细胞和A549细胞内氧化产物MDA、超氧化物、ROS的含量(p均<0.05)。但是,LMPs处理细胞后,细胞产生抗氧化物GSH的量减少(p<0.001)。2.2.2凋亡分析结果20μM的氧化应激抑制剂NAC预处理细胞可使LMPs介导的16HBE细胞的Annexin V单阳性率从14.8%下降到3.22%,使A549细胞从17.4%下降到4.60%,且均有统计学意义(p均<0.05)。结果表明NAC可逆转LMPs诱导的细胞凋亡。2.3 LMPs对气道上皮细胞氧化应激上下游机制的影响2.3.1 Western blot检测MAPK家族蛋白的变化Western blot结果显示,LMPs处理16HBE和A549细胞后,从30 min开始,与对照组相比,两种细胞中磷酸化p38表达均增加,且有统计学意义(p均<0.05)。随着处理时间的延长,两种细胞内磷酸化p38的表达逐渐增加。结果表明LMPs激活了气道上皮细胞内p38 MAPK信号传导通路。1.3.2 ELISA检测AA的含量变化(1)ELISA结果显示,LMPs将16HBE细胞产生的AA的含量从对照组的23.01±2.59μg/ml增加到45.42±2.32μg/ml(p<0.05),将A549细胞从对照组的23.01±0.77μg/ml增加到40.51±2.25μg/ml(p<0.05)。而20μg/ml LMPs仅含有少量的AA,为3.49±0.54μg/ml。(2)吞噬抑制剂细胞松弛素D逆转LMPs介导的AA的生成(p<0.05),表明LMPs可刺激内源性AA的产生。2.3.3 AA对细胞凋亡的影响细胞DNA含量流式细胞分析结果显示,100μM的AA将16HBE细胞和A549的凋亡率从对照组的0%分别增加到48.04%和50.37%;将细胞内caspase-3酶活性分别增加了3.99倍和3.17倍(p均<0.001)。结果表明AA可显著增加气道上皮细胞的凋亡。2.3.4 p38 MAPK信号传导通路对AA和ROS的影响使用p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580可将LMPs增加的AA的含量有效逆转27%(p<0.05);这个数值在A549细胞上是28%(p<0.05)。同时,SB203580可有效地降低LMPs介导的ROS的增加(p均<0.05)。说明AA和氧化应激位于p38MAPK信号传导通路的下游。2.3.5 AA对ROS的影响在两种上皮细胞中,AA的抑制剂TFP均可逆转LMPs诱导的ROS的增加(p均<0.05)。故AA调节氧化应激。2.3.6 AA对细胞凋亡的影响(1)Western Blot结果显示TFP逆转LMPs诱导的cleaved caspase-3蛋白的增加。说明TFP可逆转LMPs介导的caspase-3活化。(2)TFP将LMPs诱导的16HBE细胞凋亡率从9.88%降至1.95%,在A549细胞上则是从9.08%降至2.26%(p均<0.01)。但相同剂量的TFP本身不能诱导细胞凋亡。说明AA抑制剂TFP可逆转LMPs介导的细胞凋亡,且与TFP本身无关。3.LMPs对气道上皮细胞发挥促凋亡作用的关键成分(1)中和细胞表面抗原PSR后,Dil-LMPs(红色)进入16HBE和A549细胞胞浆的情况无明显改变(与Dil-LMPs组相比)。表明PS/PSR信号不参与LMPs被气道上皮细胞吞噬的过程。(2)Western blot显示,LMPs包含Fas L。中和LMPs含有的Fas L后,LMPs介导的细胞生长抑制效应无改变(p>0.05)。结果表明虽然LMPs包含Fas L,但Fas/Fas L信号没有参与LMPs介导的气道上皮生长抑制。(3)高温灭活LMPs后,MTT结果显示LMPs显著抑制气道上皮细胞生长的特性没有被改变。提示脂质或其他热耐受成分可能是LMPs发挥作用的关键成分。结论：1.LMPs导致气道上皮损伤,诱导气道上皮细胞凋亡,且无细胞种属无关。2.LMPs进入细胞的方式是通过细胞的吞噬作用实现的。3.LMPs对气道上皮细胞发挥促凋亡作用的具体机制是活化p38 MAPK信号通路,刺激花生四烯酸大量聚集,进而增加氧化应激,激活caspase-3。4.LMPs对气道上皮细胞的促凋亡作用是由LMPs中的脂质或其他热耐受成分引起的。结论: