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1.研究背景:乳腺癌是全球女性最为常见的恶性肿瘤,严重威胁女性健康。人表皮生长因子受体2（HER2）是乳腺癌预后不良的危险因素之一,根据其表达状态乳腺癌可被分为两大类,即HER2阳性乳腺癌和HER2阴性乳腺癌。大约15%的乳腺癌为HER2阳性,该类型乳腺癌侵袭性较强,但以曲妥珠单抗为代表的多种抗HER2靶向治疗药物极大地改善了其预后。而对于占比高达近85%的HER2阴性乳腺癌,靶向治疗药物较少,且药物适应征相对较严格,要求HER2阴性乳腺癌的激素受体状态或具有BRCA突变等,临床应用相对受限。因此,为HER2阴性乳腺癌寻找新的治疗靶点,将增加患者治疗的可选性,改善该部分患者预后。人组织激肽释放酶（KLK）家族包括15个分泌型丝氨酸蛋白酶,其中KLK4与乳腺癌关联密切。据文献报道,乳腺癌组织中KLK4基因及蛋白的表达水平均显著高于正常乳腺组织。Xiao等在Luminal型乳腺癌中进行的数据库分析发现,KLK4在HER2阴性的Luminal A型乳腺癌中更具有预后预测意义,且其高表达提示预后较好,另一项研究则通过免疫组化（IHC）方法证实,三阴性乳腺癌肿瘤间质细胞中KLK4高表达提示预后较差,而肿瘤细胞的KLK4水平与预后无明显相关性。本课题组前期亦使用IHC技术检测我科140名乳腺癌患者原发肿瘤组织中的KLK4蛋白表达水平并进行预后分析,发现肿瘤细胞及间质细胞中KLK4高表达均提示患者的总生存期（OS）更长,且肿瘤细胞中KLK4表达水平是乳腺癌患者OS的独立预后预测因素。综上,KLK4是乳腺癌极具潜力的预后预测指标,且研究者既往关于Luminal型和三阴性乳腺癌的预后分析提示KLK4可能在HER2阴性乳腺癌中更具有预后预测意义,有望为HER2阴性乳腺癌提供潜在的治疗靶点。因此,本研究拟使用数据库分析HER2阴性乳腺癌中KLK4表达水平与预后的相关性,并应用HER2阴性乳腺癌细胞系作为细胞模型,通过对其KLK4蛋白表达水平进行上调和敲低,研究KLK4对HER2阴性乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,同时探索其机制,为HER2阴性乳腺癌寻找有效的靶向治疗提供新的证据。2.研究方法:（1）通过Kaplan-Meier Plotter在线数据分析系统和BCIP在线数据分析平台,分析HER2阴性乳腺癌中KLK4表达水平与预后的相关性;（2）采用3种经典的HER2阴性乳腺癌细胞系T47D、MDA-MB-231和MCF-7作为细胞模型,其中,T47D和MCF-7为Luminal型乳腺癌细胞系,MDA-MB-231为三阴性乳腺癌细胞系。通过将人KLK4的全长编码序列/sh RNA序列插入慢病毒环状质粒,分别构建稳定过表达KLK4和敲低KLK4的慢病毒载体,而未插入相应序列的空白载体V ector/scramble分别作为对照,以上载体均同时携带Puro抗性基因。成功构建慢病毒载体后,分别感染3种细胞系并使用含Puro培养基进行细胞培养与筛选,构建稳定过表达KLK4的T47D和MDA-MB-231乳腺癌细胞系以及稳定敲低KLK4的MCF-7乳腺癌细胞系,并使用蛋白免疫印迹（Western Blot）验证其KLK4蛋白的表达水平;（3）通过克隆形成实验比较T47D、MDA-MB-231和MCF-7细胞在不同KLK4表达水平下形成克隆的个数,探索KLK4对HER2阴性乳腺癌细胞增殖能力的影响;（4）分别通过划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测T47D、MDA-MB-231和MCF-7细胞在不同KLK4表达水平下的伤口愈合速度和穿过麦氏胶的细胞个数,研究KLK4对HER2阴性乳腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响;（5）使用Western Blot检测过表达KLK4的T47D、MDA-MB-231细胞和敲低KLK4的MCF-7细胞中PI3K/AKT/m TOR及MAPK/ERK信号通路的蛋白变化,初步探索KLK4参与HER2阴性乳腺癌发生发展的机制。3.研究结果:（1）数据库分析发现,HER2阴性乳腺癌中KLK4高表达提示预后较好,而HER2阳性乳腺癌中KLK4表达水平与预后无明显相关性;（2）成功构建稳定过表达KLK4和稳定敲低KLK4的慢病毒载体LV-EF1A＞h KLK4[NM＿004917.4]-CM V＞EGFP/T2A/Puro和p LV[sh RNA]-EGFP:T2A:Puro-U6＞{sh RNA#1}以及各自的空白对照载体Vector、scamble,并分别感染T47D、MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系,经过Puro筛选,待细胞状态良好时提取蛋白质进行Western Blot发现,T47D-KLK4、MDA-MB-231-KLK4细胞的KLK4蛋白表达水平明显高于对照组细胞,MCF-7-sh KLK4细胞的KLK4蛋白表达水平则较对照组细胞明显降低,证明构建成功;（3）克隆形成实验显示,T47D和MDA-MB-231细胞在过表达KLK4后形成的克隆个数明显少于对照组细胞,细胞增殖能力减弱;相反,MCF-7细胞的增殖能力在敲低KLK4后明显增强,提示KLK4抑制HER2阴性乳腺癌细胞增殖;（4）划痕实验显示,T47D-KLK4和MDA-MB-231-KLK4细胞的迁移能力较对照组减弱,2组细胞间的伤口愈合百分比均存在统计学差异（P＜0.05）,而MC F-7-sh KLK4细胞的迁移能力较对照组增强（P＜0.01）;Transwell小室侵袭实验也表明,T47D和MDA-MB-231细胞过表达KLK4后穿过麦氏胶及小室小孔的细胞个数均低于对照组（P＜0.01）,细胞侵袭能力被抑制,同时,敲低KLK4的MCF-7细胞的侵袭能力则增强（P＜0.05）。综上,KLK4抑制HER2阴性乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力,提示KLK4在HER2阴性乳腺癌细胞中发挥抑癌作用;（5）使用Western Blot发现,过表达KLK4后,T47D、MDA-MB-231和MCF-7细胞中ERK1/2蛋白的磷酸化水平均发生变化,提示KLK4在HER2阴性乳腺癌细胞中的抑癌作用与MAPK/ERK信号通路相关。4.研究结论:（1）KLK4在HER2阴性乳腺癌中高表达提示预后较好;（2）KLK4抑制HER2阴性乳腺癌细胞的增殖能力;（3）KLK4抑制HER2阴性乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力;（4）KLK4参与调节HER2阴性乳腺癌中的MAPK/ERK信号通路。