研究背景和目的创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌属第5群细菌,根据其生化特性、流行病学模式以及宿主范围将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个亚型,其中Ⅰ型Vv是导致人群创伤感染及原发性败血症的病原体。原发性创伤弧菌感染发病率呈逐年递增的趋势。目前世界上大部分沿海国家都有创伤弧菌感染的病例报告。我国国内1990年报道首例,随后沿海各地区每年都有散发病例报道,其病死率一直居高不下。对本病的认识不足,发病早期未能正确诊断,或误诊为药物超敏反应而使用大剂量激素,是造成高病死率的主要原因。创伤弧菌的感染途径有二:一是经口感染,二是通过皮肤伤口侵入。创伤弧菌感染一旦出现败血症,其死亡率高达50%以上。那么,我们能否采取措施避免接触到创伤弧菌呢?在不可避免接触到创伤弧菌的情况下,我们能否通过机体主动免疫的方法避免其感染乃至致病呢?为此,我们设计了本课题,试图通过体外及主动免疫动物实验来回答上述问题。方法1.创伤弧菌的生化特性及抗性研究:1.1取新鲜培养的创伤弧菌接种于弧菌属生化鉴定管及生化条培养24h后,目测或上机读取鉴定结果。1.2紫外线抗性:创伤弧菌ATCC27562、大肠杆菌ATCC25922悬液及平板在强度值达90μW/cm~2的紫外线照射不同时间后,培养并定量测试照射前后的活菌浓度,统计杀菌率,绘制照射前后灭活曲线(t-Δlg)。1.3 3种消毒剂抗性:戊二醛、过氧乙酸及乙醇以无菌去离子水1:2等比系列稀释至1:256后作用于创伤弧菌,培养24h观察细菌生长情况,确定其对创伤弧菌的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC);20g/L戊二醛、5g/L过氧乙酸及75%乙醇作用于创伤弧菌10s、20s、30s、60s、90s及120s,培养24h后观察细菌生长情况,确定其对创伤弧菌的最快杀菌时效。2.创伤弧菌主动免疫预防的动物实验研究2.1创伤弧菌溶细胞毒素的提取、纯化及鉴定重组大肠杆菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3)恢复培养,行蓝白斑筛选,挑取白色菌斑进行PCR扩增并琼脂糖电泳验证目的基因存在。挑选阳性克隆并以最佳诱导条件进行诱导培养,离心收集细菌,超声破菌,离心后上清液经过His-Bind亲和层析方法纯化重组创伤弧菌溶细胞毒素(rVVC)并行SDS-PAGE电泳及Western-blot验证。纯化后的蛋白以透析法进行复性和浓缩。采用BCA(bicinchoninicacid)法进行蛋白定量,绘制标准曲线,计算出蛋白浓度。2.2创伤弧菌主动免疫预防的动物实验研究(1)实验动物及分组:SPF级BALB/c小鼠54只,雌雄不拘,随机分为创伤弧菌菌体抗原组(简称菌体抗原组)、溶细胞毒素蛋白抗原组(简称蛋白抗原组)、生理盐水对照组(简称对照组)各18只。(2)抗原制备:创伤弧菌菌体抗原,新鲜培养的创伤弧菌以0.3%甲醛灭活24h,无菌试验合格后4℃保存;创伤弧菌溶细胞毒素蛋白抗原,rVVC与完全弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂等体积乳化制成。(3)免疫方案:小鼠皮下多点注射,创伤弧菌菌体抗原组小鼠接种菌体抗原:1×10~8个/只/次;溶细胞毒素蛋白抗原组小鼠接种蛋白抗原50μg/只/次;生理盐水对照组小鼠接种生理盐水:0.2ml/只/次,0d、首次免疫14d后每10d加强一次。(4)小鼠免疫学指标:免疫接种3-6次后,每组3只小鼠取外周血行流式细胞术检测小鼠外周血中淋巴细胞亚群比例;每组6只小鼠,取脾及胸腺,称重,MTT法检测脾淋巴细胞转化率;血清凝集试验及间接ELISA法检测特异性抗体及IgG效价。(5)创伤弧菌攻击试验:3组小鼠按上述方法免疫接种6次后,12只/组,75%酒精棉球消毒右下腹皮肤后腹腔注射新鲜培养创伤弧菌ATCC27562悬液,0.5ml/只,细菌浓度约为10~7-10~8cfu/ml。监测所有小鼠一般情况,包括呼吸、精神状态、毛发、体温等。小鼠死亡后立即解剖,存活小鼠于注射活菌后48h或10d断椎法处死,取其主要脏器及组织固定、石蜡包埋后按常规方法制片、HE染色,光镜下观察其病理变化。同时取心脏内血液或血凝块进行Vv分离培养及生化鉴定。结果1.创伤弧菌抗性实验1.1创伤弧菌ATCC27562生化特性符合创伤弧菌的生化鉴别特征,生化条鉴定结果:创伤弧菌%id=99.9(机读结果显示为“非常好的鉴定结果”)。1.2创伤弧菌紫外线抗性研究创伤弧菌ATCC27562在强度值达90μW/cm~2的紫外线照射,15min后定性培养为阴性,定量检测1min平均灭活对数值(LIV)悬液法为4.37±0.13、平板法为5.10±0.19,平均杀菌率悬液法为(99.99±0.01)%、平板法为(99.99±0.05)%,照射15min后无菌存活。1.3创伤弧菌对3种消毒剂抗性研究戊二醛对创伤弧菌的MIC为0.31g/L,MBC为10.00g/L;过氧乙酸对创伤弧菌的MIC为0.04g/L,MBC为0.31g/L;乙醇对创伤弧菌的MIC为4.69%,MBC为37.50%。20g/L戊二醛作用10s、5g/L过氧乙酸作用10s、75%乙醇作用60s均能有效杀灭创伤弧菌。2.创伤弧菌主动免疫预防动物实验2.1创伤弧菌溶细胞毒素的表达、提取、纯化及鉴定蓝白斑筛选LB平板上长有白色及蓝色的单克隆细菌斑,其中白色菌落为带重组质粒的细菌,即阳性克隆。挑取白色菌斑培养,进行质粒提取,并以其为模板进行PCR扩增vvhA基因,琼脂糖电泳获得相应大小目的条带(vvhA:1356bp)。SDS-PAGE电泳显示阳性克隆重组大肠杆菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导培养,能表达融合蛋白rVVC,在凝胶上70KD的位置可见相应蛋白条带。rVVC经透析复性、浓缩后,BCA法测定蛋白浓度为2.542mg/ml。Western-blot免疫印迹实验结果表明表达产物rVVC能与抗6×His组氨酸单克隆抗体特异结合。2.2小鼠免疫学指标(1)小鼠脾、胸腺重量检测结果蛋白抗原组小鼠脾重量较对照组为高(P=0.004),差异具有统计学意义;菌体抗原组小鼠脾重量与对照组比较,P=0.919,无统计学差异。菌体抗原组、蛋白抗原组与对照组小鼠胸腺重量比较差异均无统计学意义。(2)小鼠脾淋巴细胞转化率检测结果菌体抗原组小鼠ConA刺激的T淋巴细胞转化率、LPS刺激的B淋巴细胞转化率较对照组高(P=0.018、P=0.001),差异具有统计学意义,其Vv刺激的淋巴细胞转化率较对照组高,但差异不具有显著性(P=0.216);蛋白抗原组小鼠ConA刺激的T淋巴细胞转化率、LPS刺激的B淋巴细胞转化率及rVVC刺激的淋巴细胞转化率与对照组比较,差异均无显著性。(3)小鼠外周血淋巴细胞亚群检测结果三组小鼠外周血的CD19~+ B淋巴细胞百分比差异具有统计学意义(P=0.03),菌体抗原组、蛋白抗原组均高于对照组。三组小鼠外周血的CD4~+T细胞及CD8~+T细胞之百分比差异无统计学意义,CD4~+/CD8~+比值差异也无统计学意义。(4)血清凝集试验结果第3次免疫后,菌体抗原组与蛋白抗原组小鼠血清与菌体悬液混合,呈现流沙样阳性反应;对照组小鼠血清、生理盐水与菌体悬液混合均为阴性结果。(5)小鼠血清抗体IgG效价测定结果第5次加强免疫后,取小鼠血液行间接ELISA检测血清抗菌体/rVVC蛋白IgG效价,菌体抗原组血清抗菌体效价最高达1:25600,蛋白抗原组血清抗rVVC效价最高达1:25600。以各组血清最高稀释度取对数值1g行两独立样本t-检验,结果表明:菌体抗原组小鼠抗菌体IgG效价高于对照组,差异具有统计学意义;蛋白抗原组小鼠抗rVVC蛋白IgG效价高于对照组,差异具有统计学意义。(6)Western-blot检测结果将纯化复性后的rVVC经SDS-PAGE后,转移到PVDF膜上,以鼠抗rVVC血清为一抗进行Western-blot反应,结果显示rVVC能与免疫血清特异性结合,在相应大小处(约70KD)出现了特异性反应区带。2.3创伤弧菌攻击试验结果(1)小鼠一般情况生理盐水对照组注射菌液后36h内10只小鼠死亡,2只小鼠存活,存活率为16.7%;其中一只小鼠左后肢出现脓肿、破溃及溃疡形成,后肢活动明显受限。菌体抗原组及蛋白抗原组小鼠注射菌液后出现毛发竖立、进食减少、蜷缩少动等情况,但均较对照组为轻,48b内小鼠均存活,存活率为100%。菌体抗原组及蛋白抗原组小鼠48h存活率均高于对照组,差异具有统计学意义。对照组小鼠血培养为阳性,还原鉴定为创伤弧菌。菌体抗原组及蛋白抗原组小鼠注射菌液后48h血培养为阳性,10d培养为阴性。(2)病理改变生理盐水对照组死亡小鼠各脏器组织充血淤血病变严重,局部见中性粒细胞浸润;存活小鼠各组织基本正常,其中一只后肢皮肤溃疡形成、软组织呈蜂窝织炎改变。菌体抗原组及蛋白抗原组48h处死小鼠各脏器组织轻度淤血,可见炎细胞浸润;10d处死小鼠:蛋白抗原组肝组织局部细胞灶状、片状坏死,呈脓肿样改变;其余各组织基本正常。结论1创伤弧菌ATCC27562对紫外线敏感,属紫外线低度抗性菌;90μW/cm~2的紫外线能有效灭杀创伤弧菌ATCC27562,20g/L戊二醛、5g/L过氧乙酸、75%乙醇能将其迅速有效灭活。2创伤弧菌菌体抗原、创伤弧菌溶细胞毒素蛋白抗原能有效刺激、增强BALB/c小鼠特异性体液免疫功能,产生创伤弧菌菌体抗体及创伤弧菌溶细胞毒素蛋白抗体,使小鼠获得有效的免疫保护,可作为创伤弧菌的候选疫苗进一步研究。3致死量创伤弧菌侵犯BALB/c小鼠,小鼠体内创伤弧菌菌体抗体、溶细胞毒素蛋白抗体不能完全将其杀灭,能有效减轻其毒性作用,明显提高小鼠生存率,降低致残作用。