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生命体内无规新生肽链如何折叠成为有生物活性的蛋白质是极具挑战性的问题,由于生命系统的复杂性,蛋白质折叠和解折叠的体外研究可以为此提供有价值的信息。人们利用多种技术手段研究自然界存在或人工合成的小蛋白(或多肽)折叠和解折叠过程的分子行为。其中,光谱分析法是揭示蛋白分子状态的一种灵敏的实验方法;而天然色素-蛋白复合体系是研究这一问题的理想材料。藻胆蛋白是由多个四吡咯发色团与脱辅基蛋白构筑而成的超分子复合体,是藻类的捕光色素蛋白。在折叠(复性)和解折叠(变性)过程中,藻胆蛋白会发生几十纳米的光谱位移、荧光的恢复和猝灭、能量转移效率的改变,利用这些参量可以直观地展示蛋白质分子的结构运动。R-藻蓝蛋白(R-PC)含有光谱清楚分辨的两种藻胆色素--藻红胆素(PEB)和藻蓝胆素(PCB),其高分辨晶体结构已经测定,这些成为揭示折叠和解折叠过程中蛋白分子行为的有利条件。本论文从R-PC亚基的分离、复性和表征出发,以α亚基和β亚基作为研究蛋白质折叠和解折叠的模型,通过监测光谱位移、荧光恢复和猝灭、能量转移效率等参量变化展示出蛋白质折叠和解折叠过程中亚基分子动态特性。取得的主要研究结果如下:
1.在变性条件下通过柱层析的方法分离得到R-PC的α和β亚基,然后透析除去变性剂得到复性亚基。采用分子量测定、电泳和光谱等方法对复性的亚基进行表征,证明了亚基折叠正确。利用在溶剂中亚基的光谱特性分析了亚基分子形态和溶剂相关的亚基分子聚集态特性,确定了适合亚基折叠/解折叠研究的溶剂条件。
2.以亚基的PCB色团和唯一的色氨酸残基(Trp128)作为双荧光探针,研究了α亚基的再折叠和解折叠过程。再折叠过程中PCB色素构型改变以及色素-蛋白氢键、疏水作用网络的恢复按透析时间依次发生,分别对应光谱峰的蓝移和荧光的恢复;解折叠证明了中性脲环境下不能发生色素构型转变,而仅能破坏色素-蛋白相互作用网络结构。Trp128在332nm的荧光肩峰即使在pH3.0的8M脲溶液中依然存在,说明蛋白二级螺旋结构不被破坏。
3.通过光谱响应,荧光各向异性和荧光共振能量转移等观测双色β亚基在再折叠和解折叠过程中的构象变化。发现β亚基的再折叠随透析时间经历三个阶段,第一阶段的光谱峰蓝移对应色素由卷曲构型向伸展构型转变;第二阶段的色素荧光强度和总荧光产率线性上升对应色素周围氢键和疏水作用网络结构重建,色素刚性恢复;第三阶段是荧光共振能量转移效率的增大对应于蛋白骨架的运动使两色素距离靠近和(或)分子取向夹角变小,并根据转移效率的定量改变推测出E螺旋的旋转角度。解折叠过程经历了与此相似的阶段性变化。
4.在亚基的解折叠过程中,脲、酸(pH≥3.0)、温度各自都可以引起蛋白骨架运动和破坏色素-蛋白疏水作用网络,但是都不能导致色素构型转变;只有在酸和脲并存或者pH<3.0时的强酸性条件下才出现PCB光谱峰的红移,表明色素构型改变。说明疏水网络结构的破坏是氢离子进入蛋白内部造成天冬氨酸残基(Asp87和Asp39)侧链羧基质子化的前提,后者是色素构型转变的关键,二者缺一不可。