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骆驼血清中能表达一种没有轻链的抗体,通过克隆其可变区获得了目前已知分子量最小的抗原结合片段,称为纳米抗体。与传统抗体相比,纳米抗体的分子量小,亲水性高,比较容易地与其他分子或前体药物共价连接。因此在新药开发、临床诊断等方面具有广阔的开发前景。Cathepsin蛋白家族在免疫细胞内参与抗原降解、加工和传递,进而调节宿主的免疫反应。而人体被蜱叮咬后,蜱唾液腺中的Ds Cystatin蛋白会被分泌到人体内,抑制Cathepsin蛋白家族的活性,帮助蜱长时间在宿主上吸血,逃避宿主免疫反应,促进了蜱携带的病原体传播到宿主体上。我们希望能获得针对Ds Cystatin蛋白的纳米抗体,以便帮助人们在关于蜱叮咬方面的诊断治疗中发挥作用。本研究中我们采用原核表达系统获得带有GST标签的Ds Cystatin融合蛋白,利用GST标签纯化该蛋白。纯化后的蛋白带有GST标签,使用procession蛋白酶切除,最终得到单一的Ds Cystatin抗原蛋白。用纯化后的抗原蛋白免疫健康的双峰驼,经过数次的免疫后以其外周血为材料建立纳米抗体免疫文库,利用噬菌体展示技术通过吸附、洗脱、富集等一系列操作筛选具有抗原特异性的纳米抗体。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)获得与Ds Cystatin蛋白具有特异性结合的阳性单克隆。将ELISA实验中的阳性结果摇菌、质粒抽提,送测序公司进行测序。使用相关软件对测序结果进行分析,最终获得1株纳米抗体。将所获得的纳米抗体诱导、表达、纯化后,通过pull-down技术来验证筛选到的纳米抗体与Ds Cystatin蛋白具有相互结合的作用。基于实验室的另一研究方向,我们还进行了受甲基化调控的USP44基因在食管鳞癌中相关生物学机制的研究。本部分研究中我们应用相关统计学方法,通过分析TCGA数据库中食管鳞癌甲基化差异位点并结合本实验室收集到的94对食管鳞癌组织中甲基化差异的测序结果,最终确定USP44基因在食管鳞癌中呈现显著的异常高甲基化情况。通过logistic回归计算该基因对食管鳞癌的诊断效能,结果显示诊断的敏感度为0.73,特异性为0.83,ROC曲线下面积(AUC)为0.82,说明该基因具有潜在的食管鳞癌临床诊断价值。为了进一步探究受甲基化调控的USP44基因的生物学机制,我们使用去甲基化药物(5-Aza)处理食管鳞癌细胞系Ec-109和Ca Es-17,发现在去甲基化后USP44表达量明显上升。之后我们构建了针对USP44基因启动子区的荧光素酶表达载体,并对启动子区域进行高甲基化处理,经检测后发现荧光值与对照组相比明显降低。而在患者成对的癌与癌旁组织中,USP44基因的表达量也呈现出明显的差异性。以上结果说明USP44基因在食管鳞癌中的表达是受DNA甲基化调控的,并且高甲基化导致了该基因的低表达。为了进一步探究USP44基因在食管鳞癌细胞中的作用机制,我们构建了p CDH-USP44过表达载体。经过细胞增殖、细胞迁移等实验,表明该基因在食管鳞癌细胞中起抑制肿瘤增殖的作用。通过细胞凋亡实验也表明,该基因可以促进食管鳞癌细胞的凋亡。最后,为了评估USP44基因过表达后在体内肿瘤形成过程中所起到的作用,我们进行了小鼠荷瘤试验。根据肿瘤体积的统计结果,说明USP44基因抑制了食管鳞癌细胞的增殖。