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家蚕表达系统具有高效表达、生物安全性高、易产业化生产、表达产物稳定和表达产物后加工较完善等特点,但是其高效表达受到启动子的类型、密码子的偏好性、mRNA的稳定性等因素的影响。已有报道显示外源基因在细胞发生转录的过程中,前体转录本可竞争性形成线性RNA分子（linear RNAs）和环状RNA分子（circRNAs）,从而导致蛋白质表达水平受到影响。因此,我们设想可以通过减少circRNA的形成,提高线性RNA分子水平,从而提高其蛋白质的表达水平。本研究我们探讨了突变萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase gene,luc）的反向剪接样位点（Back splicing-like sites）,提高其在家蚕培养细胞中的表达水平。1luc基因能在家蚕培养细胞中形成相应的circRNAs为了探究单个异源基因在不同细胞系中是否能够形成circRNAs分子,并明确circRNAs的形成与其同源线性RNA表达水平之间的关系,我们将由T7启动子介导的体外转录的luc RNA（T7-luc）转染家蚕卵巢细胞（BmN）,通过发散性引物（divergent primers）进行RT-PCR,并对扩增产物进行Sanger测序,结果显示能够检测到首尾相连的8种环化RNA分子,我们将其分别命名为circluc1（290-858 nt）、circluc2（360-850 nt）、circluc3（419-696 nt）、circluc4（438-728 nt）、circluc5（439-709 nt）、circluc6（441-816 nt）、circluc7（452-764 nt）和 circluc8（460-728 nt）,提示异源基因的 RNA在BmN细胞可能形成circRNAs分子。为了验证这种异源基因在细胞内发生RNA环化是否存在普遍性,我们将T7-luc RNA转染草鱼肾细胞（CIK）,以及将表达luc基因的质粒pmirGLO-luc和表达绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）基因的pLCDH-gfp质粒转染进HepG2细胞中,通过RT-PCR和Sanger测序,结果显示在CIK或HepG2细胞中,都能够检测到首尾相连的来源于luc或gfp的环化RNA分子。为了进一步确认异源基因在细胞内确实能够形成circRNAs分子,我们选择luc基因来源的circluc1作为研究对象,通过滚环扩增（reverse transcription-rolling circle amplification,TCA）和发散性引物PCR验证,证实circluc1确为环状分子,反向PCR产物检测到的接头序列同circluc1的junction site序列一致,表明luc基因确实能在BmN细胞中形成circluc1分子。利用荧光定量PCR检测8种来源于luc基因的circRNA-luc的表达丰度,结果显示circluc1和circluc2表达水平显著高于其它6种circRNA-luc;进一步对8种circRNA-luc的断裂位点（split site）进行序列分析,结果显示这些luc基因来源的circRNA-luc的反向剪接位点不同于经典剪接位点（5’-AGgt---agGT-3’）特征。pIZT-luc质粒转染BmN细胞后,荧光定量PCR检测不同时间点circRNA-luc及其同源线性mRNA的表达模式,发现它们的表达趋势相似,且mRNA的表达水平显著地高于circRNA-luc的表达水平。这些研究结果表明无内含子的异源基因进入细胞也能形成circRNAs,但形成机制不明。2突变luc反向剪接样位点提升同源线性mRNA的表达水平为了探究circRNA-luc与其同源线性mRNA的表达水平关系,我们分别突变circluc1 和 circluc2 的反向剪接样位点（back splicing-like sites）、同时突变 circluc1和circluc2的反向剪接样位点、同时突变8种circRNA-luc的反向剪接样位点,获得lucmut1、lucmut2、lucmut1-2和lucmut1-8,并将突变后的luc基因序列分别克隆进pIZT-V5/His载体,构建真核表达质粒 pIZT-lucmut1、pIZT-lucmut2、pIZT-lucmut1-2、pIZT-lucmut1-8。荧光定量PCR检测各种circRNA-luc及其同源线性mRNA的表达水平的变化,结果显示,与转染pIZT-luc的家蚕BmN细胞相比,在分别转染质粒pIZT-lucmut1和pIZT-lucmut2细胞中,相应的circluc1、circluc2的表达水平都明显下降,而其同源线性mRNA的表达水平显著上升;在转染pIZT-lucmut1-2细胞中,circluc1和circluc2的水平均下降,而相应的线性mRNA水平显著提高;在转染pIZT-lucmut1-8细胞中,8种circRNA-luc的表达水平均下降,且线性mRNA水平同样显著上升,说明突变luc反向剪接样位点可提升同源线性mRNA的水平。通过双荧光素酶报告系统检测突变luc反向剪接样位点对荧光素酶活性的影响,结果显示,与转染pIZT-luc的细胞相比,在转染pIZT-lucmut1-8细胞中,luc荧光素酶活性明显提高。这些研究结果表明circRNA的形成与同源线性mRNA表达存在竞争关系,未来可以在家蚕表达系统中通过改变外源基因内部潜在的反向剪接样位点,提升外源基因线性mRNA的表达水平。3突变luc反向剪接样位点提高重组杆状病毒在家蚕细胞中表达的luc水平为了验证在杆状病毒表达系统中突变circRNA-luc反向剪接样位点是否也具有相同的影响,我们将luc、lucmut1、lucmut2、lucmut1-2和lucmut1-8分别克隆进杆状病毒转移载体 pFastBacTM-dual 获得重组转移载体 pFast-luc、pFast-lucmut1、pFast-lucmut2、pFast-lucmut1-2、pFast-lucmut1-8。尔后,利用Bac-to-Bac系统分别构建重组杆状病毒BmNPV-luc、BmNPV-lucmut1、BmNPV-lucmut2、BmNPV-lucmut1-2 和 BmNPV-lucmut1-8。荧光定量 PCR检测结果显示,感染 BmNPV-lucmut1、BmNPV-lucmut2、BmNPV-lucmut1-2和BmNPV-lucmut1-8细胞中的luc mRNA水平均高于感染BmNPV-luc细胞,其中以感染BmNPV-lucmut1-8细胞中mRNA表达水平最高,感染BmNPV-lucmut1-2次之;Western blotting实验结果与其一致。这些结果表明了 circRNA-luc反向剪接样位点的突变可以降低circRNA的形成效率,且能够提高同源线性mRNA的表达水平。该研究结果提示,可以通过突变外源基因的反向剪接样位点来提高其在杆状病毒表达系统中的表达水平。4敲降与circluc-1形成相关的蛋白对luc基因表达水平的影响我们前期的研究工作中,发现突变circRNA-luc反向剪接样位点可提高其线性mRNA的表达水平,进一步选择了丰度值较高的circluc1作为研究对象,探讨影响circRNA-luc形成的因素,以期从细胞底盘水平进行遗传改造,提升外源基因在细胞内的表达水平。本研究中,细胞免疫荧光结果显示,circluc1主要分布在细胞质中。通过T7-luc线性RNA分别与来源于BmN细胞的胞浆和胞核孵育,RT-PCR及Sanger测序结果显示luc线性RNA与胞浆蛋白孵育后能够检测到circluc1的junction site,提示胞浆中可能存在参与外源基因RNA环化的蛋白质。实验室前期研究发现异质核糖核蛋白 Q（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q,hnRNPQ）、DEAD box polypeptide 5（DDX5）isoform 2两种蛋白参与家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）RNA 在细胞内的环化,为 了验证 hnRNPQ、DDX5 isoform 2是否影响外源基因在细胞内的环化?我们将pIZT-luc和siRNA共转染BmN细胞,荧光定量PCR检测circluc1的表达效率,结果显示沉默hnRNPQ和DDX5 isoform 2基因,导致circluc1的表达效率显著下降,而luc mRNA的表达水平显著上升。为了验证 hnRNPQ 和 DDX5 isoform 2 参与 circluc1的形成,将 pIZT、pIZT-luc、pIZT-lucmut1分别转染进BmN细胞,收集细胞裂解物,分别使用hnRNPQ和DDX5 isoform 2抗体进行 RNA 结合免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）实验,RT-PCR扩增结果显示,转染pIZT-lucmut1的细胞内circluc1表达水平远低于转染pIZT-luc细胞中的水平。初步说明hnRNPQ和DDX5 isoform 2参与circluc1的形成,暗示着抑制与circluc1相关蛋白的表达可能提高luc基因的表达水平。