论文部分内容阅读
目的：建立高效稳定的饲养层培养体系用于小鼠胚胎干细胞的分离培养；鉴定E14TG2a小鼠胚胎干细胞的生物学特性并激活其Wnt/β-catenin信号通路,探究该信号通路的激活对小鼠胚胎干细胞向造血干/祖细胞定向分化的调控作用。方法：制备小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞,用MTT法探究丝裂霉素C的最佳作用时间及浓度,从而建立高效稳定的胚胎干细胞分离培养体系；碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)染色、细胞周期检测及核型分析鉴定E14TG2a小鼠胚胎干细胞的生物学特性；用外源性蛋白wnt3a(100ng/ml)持续作用E14TG2a小鼠胚胎干细胞21d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,qRT-PCR检测Wnt信号通路下游靶标基因的表达量来确定是否激活Wnt/β-catenin信号通路；采用流式细胞仪检测造血干细胞表面标志CD34+/Sca-1+,同时用qRT-PCR检测造血相关基因的表达量,探究E14TG2a小鼠胚胎干细胞的Wnt/β-catenin信号通路激活后能否促进其向造血干细胞分化。结果：1、成功建立了高效稳定的小鼠胚胎干细胞饲养层培养体系。2、培养在饲养层上的E14TG2a小鼠胚胎干细胞在培养过程中基本保持未分化状态,细胞增殖活跃,胞内染色体没有出现异常的缺失、扩增或移位。3、E14TG2a小鼠胚胎干细胞经外源性蛋白wnt3a (100ng/ml)持续作用21d后,发现β-catenin蛋白在细胞内的含量增多；Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、 Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加。4、E14TG2a小鼠胚胎干细胞的Wnt/β-catenin信号通路激活后,诱导其向造血干细胞分化。检测结果表明CD34+/Sca-1+细胞含量显著高于对照组,造血相关基因BMP4、FLK2及CD34的表达量均增加,而抑制造血分化的基因Smad5的表达则明显受到抑制。结论：E14TG2a小鼠胚胎干细胞经外源蛋白wnt3a (100ng/ml)持续作用21天后Wnt/β-catenin信号通路被激活,并促进其向造血干细胞的定向分化。