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肾间质纤维化(Renal Interstitial Fibrosis，RIF)是多种肾脏疾病进展到终末期肾病(End-Stage Renal Disease，ESRD)的共同途径和主要病理改变。慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease，CKD)无论病因如何，发展到肾间质纤维化阶段，肾功能将进行性下降并最终需要替代治疗。因此，充分了解肾间质纤维化发生的原因和机制，找到控制纤维化的方法，对于改善慢性肾脏疾病患者的生存质量并延长其生存期具有重要意义。上皮-间充质转分化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）在肾间质纤维化过程中扮演着重要的角色，转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)则是最关键的促肾小管间质纤维化的生长因子之一，能独立启动并完成EMT的全过程。近年来随着生命科技的迅猛发展，我们对人体生理、病理生理的认识越来越丰富，以往被认为是转录垃圾、不编码蛋白的非编码RNA因为功能巨大而逐渐受到重视。其中一类长约22nt、在转录后水平实现负向调控基因的非编码小分子RNA，miRNA(microRNA)在各个领域极为活跃。miRNA在EMT中的作用已有部分研究，但是与miRNA的总数相比微乎其微，因此继续探讨EMT相关miRNA的功能与机制，可能给EMT与相关疾病的防治带来新的思路。本实验组前期运用醛固酮灌注小鼠，取模型小鼠与假手术组小鼠第1天和第3天的肾皮质和线粒体进行miRNA芯片分析。结果揭示与假手术组相比，模型组miR-30e*于第1天和第3天在肾皮质和线粒体均显著高表达。本研究分为三个部分： 第—部分：miR-30e*在 TGF-β1诱导的近端肾小管上皮细胞EMT中的作用。 目的：观察miR-30e*在TGF-β1诱导的近端肾小管上皮细胞(mPTCs，mouseproximal tubular cells) EMT过程中的作用。 方法：⑴用10ng/mlTGF-β1处理mPTCs:0h、24h、48h收集细胞，qRT-PCR检测钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、a-平滑肌肌动蛋白(a-smoothmuscle actin，α-SMA)的表达;western blot方法检测E-cadherin、vimentin、α-SMA的表达。⑵用不同浓度的TGF-β1（0，1，5，10，20ng/ml）刺激mPTCs24h或10ng/mlTGF-β1处理mPTCs:0h、6h、12h、24h、48h，应用实时定量PCR(quantitive real time PCR，qRT-PCR)检测miR-30e*的表达。⑶培养稳定高表达miR-30e*的细胞株以及相应的对照，用10ng/mlTGF-β1处理24h后，qRT-PCR和western blot方法检测E-cadherin、vimentin、α-SMA的表达。⑷分别用阴性对照NC和miR-30e*mimic转染mPTCs，4h后加入TGF-β1，qRT-PCR和western blot方法检测E-cadherin、vimentin、α-SMA的表达。 结果：①qRT-PCR和western blot研究发现10ng/ml TGF-β1处理mPTCs24h可显著抑制E-cadherin的表达（下降34％，P＜0.05），增加α-SMA和vimentin表达（分别增高8.3倍和5.7倍，P＜0.05），48h时比24h时的改变更明显(E-cadherin下降36％，α-SMA增高12.3倍，vimentin增高7.6倍，P＜0.05)。②TGF-β1呈剂量依赖性降低miR-30e*的表达，10ng/ml时开始明显降低(下降27％，P＜0.05)。qRT-PCR表明10ng/mlTGF-β1可时间依赖性降低miR-30e*的表达，24h时开始明显降低（下降了23％，P＜0.05）。③在10ng/mlTGF-β1的作用下，稳定过表达miR-30e*组较NC组相比E-cadherin的表达升高(增高1.3倍，P＜0.05)、α-SMA和vimentin表达降低（分别下降35％和16％，P＜0.05）。④在10ng/mlTGF-β1的作用下，瞬时转染miR-30e*过表达组较NC组相比E-cadherin的表达明显升高（增高1.8倍，P＜0.05）、α-SMA和vimentin表达明显降低（分别下降39％和52％，P＜0.05）。 结论：TGF-β1可抑制小鼠近端肾小管上皮细胞miR-30e*表达;过表达miR-30e*能部分逆转TGF-β1诱导的mPTCs间充质转分化。 第二部分：Snail1是miR-30e*的直接靶基因。 目的：筛选并鉴定肾小管上皮细胞中miR-30e*的靶基因。 方法：⑴利用靶基因预测软件预测miR-30e*的靶基因。⑵培养稳定过表达或敲低表达miR-30e*的细胞株，qRT-PCR和western blot方法筛选预测到的靶基因。⑶qRT-PCR和western blot方法检测TGF-β1诱导小管上皮细胞EMT的过程中Snail1的表达。⑷过表达miR-30e*后，再用TGF-β1刺激小管细胞，qRT-PCR和western blot方法检测Snail1的表达。5.荧光素酶报告实验验证Snail1是否miR-30e*的直接靶基因。 结果：①三个靶基因预测软件（DIANAmT、RNAhybrid、PICTAR4）均预测到Snail1是miR-30e*的靶基因，并定位到Snail1基因的3UTR第720-726位。②高表达miR-30e*的细胞Snail1的表达下降，低表达miR-30e*的细胞Snail1表达升高， miR-30e*与Snail1的表达呈负性相关。③TGF-β1显著上调Snail1的表达（增高1.9倍，P＜0.05），过表达miR-30e*能降低TGF-β1诱导的Snail1表达。④荧光素酶报告实验显示Snail1的3UTR野生型与miR-30e* mimic共转染细胞，荧光素酶活性显著降低（降低47％，P＜0.05），其与miR-30e* inhibitor共转染细胞荧光素酶活性显著增高（增高1.77倍，P＜0.05）。 结论：Snail1是miR-30e*的直接靶基因。 第三部分：miR-30e*/Snail1轴在近端肾小管上皮细胞EMT中的作用。 目的：观察miR-30e*是否通过降低Snail1阻断TGF-β1诱导的EMT。 方法：⑴过表达Snail1，分为四组:pcDNA3.1组，pSnail1组，pcDNA3.1+TGF-β1组，pSnail1+TGF-β1组。qRT-PCR和western blot方法检测Snail1、E-cadherin、α-SMA和vimentin的表达。⑵miR-30e* mimic和pSnail1同时转染近端肾小管细胞，分别以pcDNA3.1和pSnail1;NC和miR-30e*mimic为对照。再应用10ng/mlTGF-β1刺激24小时，qRT-PCR检测E-cadherin、α-SMA和vimentin的核酸水平表达变化;TGF-β1刺激48小时后应用western blot方法检测E-cadherin、α-SMA和vimentin的蛋白水平表达变化。⑶miR-30e* inhibitor和Snail1 siRNA分别转染以及共转染小管细胞，24小时后收集细胞，qRT-PCR检测E-cadherin、α-SMA和vimentin的核酸水平表达变化。48小时后收集细胞，western blot方法检测E-cadherin、α-SMA和vimentin的蛋白水平表达变化。 结果：①过表达Snail1加重了TGF-β1诱导的EMT，表现为在TGF-β1作用下，过表达Snail1组的E-cadherin表达较pcDNA3.1组进一步下调(降低38％，P＜0.05)，而α-SMA和vimentin则进一步增高（分别增高1.4倍和1.3倍，P＜0.05）。②转染miR-30e*mimic能解除Snail1对TGF-β1诱导EMT的促进作用，而Snail1过表达则阻断了miR-30e*mimic的作用。③miR-30e*inhibitor转染细胞出现EMT，用siSnail1干扰Snail1的表达后该过程被部分阻断。 结论：体外过表达miR-30e*通过下调Snail1阻断TGF-β1诱导的EMT，敲低miR-30e*则部分通过上调Snail1介导EMT。