Synaptotagmin（Syt）是一个广泛存在于神经和内分泌细胞内的分泌囊泡上的蛋白质家族。作为钙离子依赖性神经递质和激素释放过程中的钙离子感受器, Synaptotagmin触发和调节囊泡与靶膜的融合过程,参与对神经递质和激素释放过程的严格调控,也可能参与对细胞的蛋白质与膜转运的调节。该家族在哺乳动物中有16种亚型。它们在细胞内有各自不同的定位,并发挥不同的调节功能。通过亚型间以及亚型和效应分子间的相互作用,特别是对钙离子的结合,Synaptotagmin对胞吐过程进行着有效地调控。在膜融合的事件中,如果不是全部,至少有很大一部分是需要钙离子的存在的。Synaptotagmin就可能是一种在较为宽广范围的膜融合事件中广泛分布的钙离子敏感的融合机制中的调控蛋白。 本文通过对Synaptotagmin I（SytI）和IX（SytIX）亚型的研究,以期寻找较为合适的研究方法以便于在多亚型的蛋白家族功能的研究中进行有效的功能定位。从而为Syt家族及相关蛋白家族的功能研究提供高效筛选方法。 通过RNA干扰（RNAi）技术,在RNA的后转录阶段将Syt基因的表达进行沉默,将SytI和SytIX的表达量降至原表达量的10%-20%,形成Knockdown的效果,并在此基础上对沉默的Syt基因进行功能变化的检测。并对siRNA和shRNA在沉默效果和在研究中的互补作用进行比较。另外,在实验中还使用全新的量子点耦联的抗Syt的IgG作为免疫荧光标记探针,并在内吞囊泡影像跟踪中标记Syt蛋白。实验选用INS-1细胞和PC12细胞作为实验对象,研究Syt在内分泌和神经内分泌细胞中囊泡分泌事件中的不同功能。用膜电容检测技术和碳纤电极安培检测技术对细胞中囊泡分泌事件过程中的膜电容和电化学反应进行检测,来标定细胞功能的变化。 实验结果表明,在一致的原则下设计的siRNA和shRNA有一致的沉默效率。且siRNA的sense链3’端的悬挂核苷酸的有无对siRNA的沉默效率没有影响。通过选择合适的目标序列,shRNA的沉默效率可达到约80%程度。免疫荧光检测结果显示,SytI在INS-1细胞和胰岛素颗粒共存;在PC12细胞中和致密核心囊泡共存。 功能研究表明:与对照样本相比较,由于INS-1细胞中Syt I表达沉默导致的胞吐对钙离子敏感性的降低,钙依赖的胞吐中快成分被明显降低,胞吐的速率常数也发生明显变化,同时融合孔的扩展受到抑制;在随后的胞吞事件中,和对照样本相比,快速胞吞成分明显减小,胞吞的速率常数显著地下降。在INS-1细胞中,Syt IX的沉默对分泌过程没有影响。PC12细胞中,分别对Syt I和SytIX沉默并没用影响LDCV钙依赖的胞吐过程,但同时对Syt I和SytIX进行沉默时,胞吐明显被抑制。推测在INS-1细胞内SytIX对SytI没有功能冗余作用,而在PC12细胞中,则存在相互间的功能冗余作用。也表明了在INS-1细胞和PC12细胞中,同一分子的不同功能定位。 用量子点耦联的抗SytI的IgG对PC12细胞进行孵育对内吞囊泡进行标记,可见标记的荧光颗粒向膜运动和离膜运动,其特征符合LDCV的特性。 通过实验结果我们得到下列结论: 1)siRNA和shRNA的设计可统一到Ui-Tei等的设计方法上,分子结构的变化不影响siRNA的沉默功效。对目标基因的表达进行沉默时,siRNA具有快捷的特点,同时又具有与shRNA相当的沉默效率,故siRNA可作为RNAi技术中序列筛选的有效工具。校正的Western blot结果能更好体现沉默的效率。 2)Syt I在INS-1细胞内和胰岛素分泌颗粒共存,并在钙依赖的胰岛素分泌中担当主要的钙感受器,触发钙依赖的胞吐过程,并参与随后的胞吞过程。Syt IX在INS-1细胞内对Syt I没有功能补偿作用。通过比较在PC12细胞中的结果推测,Syt IX在PC12细胞内对Syt I缺失有补偿余作用。 3)量子点除有荧光强度大的特点外,与EGFP这样的荧光蛋白一起使用时可使用单一的488nm激发同时激发;另外利用anti-SytI-Qdots可对胞吐后暴露在细胞膜外的Syt I的N端进行标记,并通过胞吞进入胞内,对内吞膜的循环进行跟踪。显示了良好的标记特性和生物学特性。