论文部分内容阅读
ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,ε-PL）是由2530个L-赖氨酸（L-Lys）单体经α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成的聚合物。由于其安全性高、抑菌谱广、热稳定好等特点,因此被广泛应用于食品、医疗和环保等多个领域。然而目前ε-PL生产菌的改造主要围绕在紫外诱变、复合诱变和基因组重排等非理性育种方面,本研究试图通过基因组重排（Genome shuffling,GS）方法获得ε-PL产量提高的菌株,进而运用代谢通量分析手段分析其高产机理,为进一步的ε-PL产生菌的定向改造奠定一定的理论基础。本文采用基因组重排方法选育ε-PL耐受型高产菌株Streptomyces sp.AF3-44,构建了Streptomyces合成ε-PL代谢网络模型,并对比了亲本菌株与突变株分批发酵条件下对数生长中期的代谢通量分布,同时在代谢网络分析的基础上,以ε-PL产量为指标,考察6种外源添加物对AF3-44合成ε-PL的影响。主要内容与结果如下:以Streptomyces sp.AS32和Streptomyces albulus F15为出发菌株,经过三轮GS获得了一株ε-PL耐受型高产菌株AF3-44,其摇瓶产量为3.1 g·L-1,较亲本菌株AS32和F15分别提高了34%和29%。传代实验表明AF3-44具有良好的遗传稳定性。突变株AF3-44与其亲本菌株AS32和F15在相同条件下,使用3 L发酵罐进行ε-PL分批发酵,分析AF3-44较亲本菌株在相同发酵状态对数生长中期代谢网络的代谢流分布和关键酶酶活性变化,对Streptomyces sp.合成ε-PL的机理进行探究。结果表明:AF3-44流向磷酸戊糖途径（PPP）和三羧酸循环（TCA）的代谢通量位于亲本菌株中间水平,流向ε-PL的代谢通量较亲本菌株AS32和F15分别提高了75.6%和49.9%。代谢通量分析结果表明高的ε-PL合成通量、以及PPP和TCA的重新分配导致了ε-PL产量的提高。在Streptomyces sp.代谢网络研究的基础上,考察外源添加葡萄糖酸钙、氯化钙、L-赖氨酸、L-天冬氨酸、延胡索酸和琥珀酸对AF3-44合成ε-PL的影响。结果表明外源添加4 g·L-1的葡萄糖酸钙对AF3-44合成ε-PL有明显促进作用,ε-PL产量提高了15%,对AF3-44关键酶酶活性分析表明:添加4 g·L-1的葡萄糖酸钙能够提高ε-PL合成通量同时促进发酵后期己糖激酶和丙酮酸激酶的酶活力,有利于菌体的生长和ε-PL的合成。