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黏膜相关恒定T细胞(Mucosal-associated invariant T cells,MAIT cells)是一群进化保守的T淋巴细胞,MAIT细胞识别抗原与传统淋巴细胞不同,它是通过主要组织相容性复合物相关蛋白1(Major histocompatibility complex classⅠ-like molecule,MR1)识别肠道细菌所特有的核黄素合成通路得以激活并发挥作用。MR1是MAIT细胞发挥正常功能的重要分子。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是一种胞内寄生菌,能够引起人类、畜禽动物肠道疾病,因其危害巨大而受到广泛关注。鼠伤寒沙门氏菌通过肠上皮组织进入肠系膜淋巴结后向循环系统扩散,进而引起肠道及机体免疫应答。因此,本研究以MR1基因缺失小鼠和C57BL/6J野生(Wild type,WT)小鼠为研究对象,探讨MAIT细胞缺失对小鼠机体抵抗鼠伤寒沙门氏菌感染能力和肠道菌群的影响,阐述其调控机体抗鼠伤寒沙门氏菌的机制。本研究中,我们首先应用成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白质9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)基因编辑技术,通过体外转录获得可注射的MR1基因导向RNA(guide RNA,g RNA),将g RNA和Cas9蛋白质共同胞质注射到受精卵中,移植到受体母鼠获得基因编辑始祖(Founder,F0)嵌合体小鼠。通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和序列测定确定小鼠基因型,在此基础上对动物进行繁殖,通过F0代嵌合小鼠与野生小鼠交配获得F1代杂合子小鼠种群,连续交配建立可遗传的MR1敲除群体,最终成功获得MR1基因敲除小鼠。其次,为研究MR1基因缺失的巨噬细胞对鼠伤寒沙门氏菌感染后的保护机制,试验分离野生型和MR1基因缺失小鼠的骨髓巨噬细胞,体外细胞试验证明,鼠伤寒沙门氏菌感染骨髓巨噬细胞的过程中,MR1基因缺失小鼠的巨噬细胞在吞噬和杀伤的作用均受到抑制,共刺激分子CD40,CD80和CD86,NO和ROS的表达量减少,巨噬细胞功能受损。体内试验证实,MAIT细胞和巨噬细胞对感染鼠伤寒沙门氏菌的小鼠具有良好的保护作用,MAIT细胞和巨噬细胞缺失显著提高小鼠脾脏和肝脏以及肠系膜淋巴结中沙门氏菌数量。将分离得到的骨髓巨噬细胞与鼠伤寒沙门氏菌共培养,进行转录组测序,转录组数据共鉴定出有170个差异基因显著表达,其中有161个m RNAs显著下调,9个m RNAs显著上调,且多数差异表达基因与免疫进程相关。与MR1基因高表达相比,MR1基因缺失小鼠骨髓巨噬细胞CD4基因显著上调。MAIT细胞作为一种重要的免疫细胞,在CD4基因调控骨髓巨噬细胞下参与鼠伤寒沙门氏菌的疾病过程,说明MR1基因对维持巨噬细胞正常免疫功能具有重要作用。接下来,将小鼠分为四组进行试验:野生型小鼠(WT),MR1基因敲除小鼠(MR1-/-),感染鼠伤寒沙门氏菌的野生型小鼠(WT+Sal),感染鼠伤寒沙门氏菌的MR1敲除小鼠(MR1-/-+Sal)。感染小组小鼠灌胃10~8CFU鼠伤寒沙门氏菌,建立感染模型,对照组给予PBS,每日称体重,记录死亡情况,第七天处死小鼠,收集血清,十二指肠和盲肠内容物,通过细菌移位试验和组织石蜡切片观察组织细菌移位和病变情况。鼠伤寒沙门氏菌感染增加MR1-/-小鼠的死亡率,加重肝脏和脾脏的病变程度。流式细胞术检测脾脏、肠系膜淋巴结CD4+T细胞的细胞因子,核转录因子的表达情况,MAIT细胞缺失诱导小鼠产生Th1/Th2/Th17/Treg混合细胞反应、降低IFN-γ,IL-4,IL-17的表达,提高IL-10的表达,并且提高十二指肠中SIg A的产生。通过16S r DNA高通量测序发现,MAIT细胞缺失及缺失后感染鼠伤寒沙门氏菌肠道微生物区系发生改变,增加小鼠沙门氏菌属的易感性和肠道定植。以上结果表明,MAIT细胞为肠系膜淋巴结和脾脏中T淋巴细胞活化提供了条件,诱导小鼠产生特异性CD4+T细胞反应,MAIT细胞缺失显著升高与炎性因子正相关的菌属,增加鼠伤寒沙门氏菌感染造成的炎症严重程度,并加剧肠道菌群稳态失调。最后,为进一步揭示MAIT细胞对鼠伤寒沙门氏菌感染起到的作用,反向回输MAIT细胞激动剂5-A-RU,WT小鼠在回补维生素B2前体5-A-RU后激活MAIT细胞,小鼠死亡率有所减轻,肝脏脾脏细菌移位情况减轻,而MR1基因缺失小鼠死亡率没有变化,表明MAIT细胞在鼠伤寒沙门氏菌感染过程中具有保护作用。MAIT激动剂诱导小鼠产生Th1/Th2/Th17/Treg混合细胞反应,提高IFN-γ,IL-4,IL-17的表达,降低IL-10的表达。MAIT细胞可调节盲肠内容物中氢化可的松和色氨酸代谢产物的紊乱,主要机制为调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和维生素B6代谢通路,调节炎症反应,介导肠道微生物代谢进程。综上所述,本研究以MAIT细胞缺失小鼠和WT小鼠为研究对象,通过构建鼠伤寒沙门氏菌感染模型,确定肠道菌群在调节MAIT细胞抵抗鼠伤寒沙门氏菌感染机制,为鼠伤寒沙门氏菌的治疗提供了新的思路。