论文部分内容阅读
【背景】恐惧记忆（fear memory）是对刺激、情景及结果的联想学习能力,是一种强烈、持久的记忆形式。其相关研究通常以巴甫洛夫条件性恐惧（Pavlovian fear conditioning）模型为基础。恐惧记忆消退是指在不呈现非条件性刺激的情况下反复接触无害的条件性刺激,会导致条件性恐惧反应逐渐减少。恐惧记忆消退是暴露疗法的基础,后者是创伤后应激障碍、焦虑症以及压力相关疾病的主要治疗方法。恐惧记忆的消退是新的学习而非遗忘,消退学习较最初的联想学习表现出更显著的环境依赖性。但消退记忆是不稳定的,这就导致暴露疗法的效果有时是短暂的,部分患者在治疗结束后依然有恐惧复发的可能。表观遗传学（epigenetics）是指非核苷酸序列改变所致的基因表达和调控的可遗传的表型变化。表观基因组的长期变化具有持久抑制原始恐惧记忆的作用,因此可能积极支持暴露疗法。目前的研究表明,表观遗传机制涉及恐惧记忆的各个阶段,从最初的形成、巩固到恐惧记忆的消退和重现。m~6A甲基化修饰作为重要的转录后调节因子,对于调控海马依赖性学习记忆、恐惧记忆的形成、巩固以及压力诱导的行为至关重要。但其在恐惧记忆消退中的确切作用及其机制仍不清楚。因此,深入研究m~6A甲基化参与恐惧记忆消退的神经生物学机制将丰富对恐惧相关过程的探索,有望促进对于恐惧记忆消退障碍的精神和神经疾病的理解。【目的】检测海马m RNA的m~6A甲基化水平在恐惧记忆消退中的改变,探讨海马不同细胞类型的m~6A甲基化与恐惧记忆消退的必要关系,寻找海马的m~6A甲基化修饰参与恐惧记忆消退调控的下游靶标。【方法和结果】1.建立恐惧记忆消退动物模型。通过m~6A甲基化水平定量检测实验发现消退训练后0.5 h小鼠海马m RNA上的m~6A甲基化水平增加。2.繁育谷氨酸能神经元、GABA能神经元和星形胶质细胞上METTL3的条件性基因敲除小鼠,分别称为Mettl3-Vglut1-Cre、Mettl3-Gad2-Cre和Mettl3-Gfap-Cre小鼠。待小鼠成年后腹腔注射Tamoxifen诱导基因敲除。利用免疫荧光染色,我们确认了Cre-Lox P重组酶系统在三种条件性基因敲除小鼠中成功介导了特定细胞类型上的METTL3敲除。利用qRT-PCR实验,我们发现三种条件性基因敲除小鼠较同窝野生对照小鼠其海马Mettl3基因表达水平显著下降。接着,利用m~6A甲基化水平定量检测实验我们证实条件性基因敲除小鼠其海马m~6A甲基化水平下降。旷场和高架十字迷宫实验表明三种条件性基因敲除操作不影响小鼠的自发活动行为、未导致焦虑样行为。对三种条件性基因敲除小鼠进行恐惧记忆消退实验,结果表明,星形胶质细胞而非谷氨酸能神经元、GABA能神经元上的METTL3敲除会导致小鼠恐惧记忆消退受损,但不影响恐惧记忆的获得和提取。恐惧记忆的消退和空间逆转学习均是认知灵活性的一种形式,利用反转水迷宫实验,我们的结果进一步表明星形胶质细胞上METTL3的条件性敲除会造成小鼠反转水迷宫中的认知灵活性受损。另外,星形胶质细胞上METTL3的条件性敲除不影响小鼠的恐惧分辨能力、空间学习记忆能力、运动协调性及短期记忆。3.利用Cre-Lox P系统原理,海马定位注射携带星形胶质细胞特异启动子的重组酶AAV至Mettl3flox/flox小鼠,实现海马星形胶质细胞上METTL3的特异性敲除。通过免疫荧光染色,我们发现携带星形胶质细胞特异启动子的AAV能成功标记小鼠海马星形胶质细胞并实现METTL3的特异性敲除。通过旷场和高架十字迷宫实验我们证明海马星形胶质细胞上METTL3的特异性敲除不影响小鼠的自发活动行为、未导致焦虑样行为。我们还证实海马星形胶质细胞上METTL3的特异性敲除不影响小鼠的恐惧分辨能力。通过恐惧记忆消退实验,我们发现海马星形胶质细胞上METTL3的特异性敲除会导致小鼠消退学习能力受损及恐惧记忆消退受损。4.对星形胶质细胞上METTL3的条件性敲除小鼠及其对照的海马脑区进行绝对定量转录组测序,从整体水平研究星形胶质细胞上METTL3的条件性敲除后海马的转录本信息。根据测序结果,我们考虑将Grin2b视为重点差异基因。5.qRT-PCR实验表明条件性恐惧记忆训练后24 h（消退训练前）,星形胶质细胞上METTL3的条件性敲除小鼠海马Grin2b表达水平显著增加。含Glu N2B亚基的NMDAR选择性阻断剂在恐惧记忆消退训练前0.5 h给予小鼠腹腔注射可在第三天测试时逆转星形胶质细胞上METTL3的条件性敲除导致的恐惧记忆消退缺陷。含Glu N2B亚基的NMDAR选择性阻断剂在恐惧记忆消退训练前0.5 h的海马内给药可促进消退记忆的获得并逆转星形胶质细胞上METTL3的条件性敲除导致的恐惧记忆消退缺陷。Me RIP-q PCR实验表明星形胶质细胞上METTL3的敲除小鼠其海马Grin2b的m~6A甲基化水平下降。【结论】海马星形胶质细胞上的m~6A甲基化修饰通过调控含Glu N2B亚基的NMDAR促进恐惧记忆消退。