家蚕(Bombyxmori)作为鳞翅目昆虫的模式生物在中国的饲养历史悠久,在丝绸产业以及生物学研究中具有重要的地位。家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)是世界上最早发现的昆虫病毒,属于αα杆状病毒属的Ⅰ型杆状病毒。由该病毒引起的疾病具有传播快、感染力强、致死率高、难防治等特征,是养蚕业中三大病毒病中危害最为严重的一种,严重影响并阻碍蚕丝产业的发展。BmNPV侵染家蚕及家蚕抗病毒感染的分子机制的探究一直以来是本领域的重点和热点,而BmNPV入侵家蚕的分子机制至今尚不完全明确。BmNPV主要通过经口途径感染家蚕,而在家蚕体内中肠(Midgut)与围食膜(PeritrophicMembrane)一起组成抵御外源微生物入侵的第一道屏障,因此从中肠与围食膜出发研究病毒与宿主的互作对了解病毒感染与家蚕免疫防御具有重要意义。本实验室前期使用一维、二维电泳技术分离家蚕中肠蛋白,并通过病毒孵育法结合MALDI-TOF-MS质谱技术筛选并鉴定得到了 12个与BmNPV互作的中肠蛋白,这些蛋白分别为:60kDa heat shock protein(HSP60),Vacuolar ATP synthase catalytic subunit B(ATP-B),Enolase(En),Actin(Actin),Arginine Kinase(AK),Ribosomal PO protein(RPO),Mitochondrial prohibitin complex protein 2(PHB2),Phosphpglycerate kinase(PGK),Ganglioside-induced differentiation-associate-protein(GDAP),Regucalcin-likeisoform X1(RCX1),Calreticulin(CRT)以及 Vacuolar ATP synthase catalytic subunit A(ATP-A)。本研究为进一步验证这12个蛋白与BmNPV的体外互作关系,以设计的特异性引物扩增这些蛋白的基因,并将这些基因分别连接到表达载体pET-28a或pGEX-4T-1上构建重组质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中使用IPTG进行诱导表达,使用亲和层析法纯化表达的融合蛋白,Western Blot检测纯化的蛋白。分别使用正向与反向的Far Western Blot技术验证这些蛋白与病毒的相互作用。为探究围食膜在BmNPV入侵时的作用,我们选取感性品系P50与抗性品系A35家蚕分别进行添食与不添食BmNPV处理,选取不同时间段围食膜进行扫描电子显微镜观察围食膜形态学变化。提取围食膜总蛋白,结合Far Western Blot与LC-MS/MS质谱筛选并鉴定与病毒具有互作关系的围食膜蛋白,使用RT-qPCR对对应基因在不同抗性品系P50、A35、BC9以及添食BmNPV后进行转录水平验证。研究结果如下:1、成功提取了家蚕中肠总RNA并反转录获得cDNA,获得了 12个目的基因且测序结果与NCBI上公布的序列一致。重组质粒构建成功并诱导表达出目的蛋白,并对表达的融合蛋白进行了纯化。2、纯化的目的蛋白与BmNPV的双向互作结果表明除AK、RCX1外其他目的蛋白均得到了明显的杂交信号条带,进一步明确了 BmNPV与这些蛋白的互作关系。3、扫描电子显微镜结果显示添食BmNPV后,P50围食膜在4h就出现破损,而A35在6h后才开始破损,P50围食膜在12h出现大量穿孔而同时间点的A35只有少量穿孔,表明围食膜在抵御BmNPV入侵中具有重要作用。4、获得了 3个能与BmNPV结合的围食膜蛋白,质谱鉴定显示这3种蛋白均为蛋白酶类,分别为 Triacylglycerol lipase(TGL)、Serine protease precursor(SPP)和Trypsin-like protease(TLP)。RT-qPCR分析显示其对应基因在不同抗性品系家蚕以及添食BmNPV后的表达水平均存在显著变化。总之,本研究成功的验证了 10个中肠蛋白与BmNPV病毒的互作关系,同时初步探索了围食膜在抵御BmNPV病毒的作用,筛选了与BmNPV病毒的围食膜蛋白。这些结果为深入了解BmNPV的入侵机理以及解析家蚕对病毒感染的免疫应答的分子机制的研究提供参考。