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结核分枝杆菌是一种寄生于宿主巨噬细胞的致病菌。它能成功寄生直接归功于它能改变吞噬小体的内环境并阻止吞噬小体成熟,防止其内环境酸化,将细胞器水解。巨噬细胞作为体内重要的免疫细胞,病原菌和宿主细胞之间的相互影响折射出一场需要加以控制的持续战斗。同时,结合分支杆菌具有致密复杂的细胞壁结构,包括内膜,肽聚糖/阿拉伯半乳糖层,分枝菌酸层和最外层的胶囊层。疏水性的细胞壁结构帮助结合分支杆菌抵御来自免疫系统的攻击,也阻止抗菌药物深入细胞内。结合分支杆菌具有一套非常特殊的分泌系统:ESX分泌系统。ESX分泌系统又称为Ⅶ型分泌系统,其底物因不具有明显的信号肽序列而区别于传统的分泌系统。同时,电子显微镜下观察结核分枝杆菌,未见明显孔道状突起结构,这使结核分枝杆菌的分泌系统区别于早期发现的Ⅰ-Ⅵ型分泌系统。 结核分枝杆菌通过向外分泌一系列毒力蛋白来改变宿主细胞内环境,逃避免疫监视,潜伏在巨噬细胞内。ESX分泌系统参与运送毒力因子穿过复杂细胞壁结构直至细胞外。ESX分泌系统具有五个分支途径,其中ESX-1因直接参与结核分枝杆菌致病过程而备受关注。ESX-1分泌途径参与转运结合分支杆菌的关键性毒力蛋白ESAT-6。ESAT-6是结核分枝杆菌从巨噬细胞内逃逸的关键因子,因其在细胞膜上穿孔的能力,结核分枝杆菌可由巨噬细胞内逃逸至细胞间质。EspB是ESX-1分泌途径的重要底物之一,EspB与ESAT-6具有共分泌的特点,EspB缺陷型结核分枝杆菌的细胞培养液中无ESAT-6被检测到,而胞内可检测ESAT-6存在。即EspB缺陷株无法将ESAT-6运送至胞外。另一方面,结合分支杆菌内膜上存在着由ESX-1底物组成的分泌机器,负责运送ESX-1分泌蛋白通过内膜至细胞周质空间。EspB和ESAT-6均与该分泌机器组分相互作用而被转运。其中EspB可被分泌机器组分之一-MycP1酶切。MycP1具有枯草杆菌蛋白酶活性,可对EspB的C末端进行酶切,实验证明MycP1参与调节结核分枝杆菌毒力因子ESAT-6的分泌剂量。在MycP1失活的菌株中,ESAT-6分泌量大大增加,造成结核分枝杆菌侵染宿主后,在宿主体内引起强烈的免疫反应,结果是结核分枝杆菌短时间内即被宿主细胞清除。基于以上事实,我们推测MycP1通过对EspB酶切来调节ESAT-6的分泌剂量。 通过对EspB晶体以及冷冻电镜结构解析,我们获得高分辨的晶体结构及相对分辨率较高的电镜结构。EspB晶体结构揭示其具有刚性较强的七聚体helix束孔道结构,相邻单体间通过氢键和静电作用维持七聚体的构象,单个点突变,缓冲液pH变化或者缓冲液离子强度的变化都无法使EspB转变为单体构象。同时,EspB具有ESX-1分泌支路底物的保守结构域:WxG和YxxxD结构域,Tyr81中苯环上的氧原子和Trp176中芳香环上的氮原子形成键长为3.02(A)的氢键。周围的疏水残基为这对氢键提供了稳定作用。EspB电镜结构展示出EspB的C端结构,结合钙离子使EspB的C端由闭合转台转变为开放状态。EspB截短体电镜结构显示酶切后的EspB的C端处于闭合状态,不会因为结合钙离子而开放。由此推测,在结合分支杆菌体内,EspB作为负责运送ESAT-6/CFP-10的孔道结构存在,钙离子结合使EspB开放,运输ESAT-6/CFP-10,经过MycP1酶切的EspB会关闭而不能允许ESAT-6/CFP-10通过。即结合分支杆菌通过MycP1对EspB的修饰来调控毒力因子ESAT-6的分泌。我们通过结核分枝杆菌的模式生物-耻垢分支杆菌,验证这一推测的正确性。我们分别用野生型,突变体,截短体EspB来回补耻垢分支杆菌EspB缺陷株,实验证明只有用野生型质粒回补,能正确表达EspB七聚体的菌株,才能在细菌培养液中检测到ESAT-6/CFP-10,表达单体或者截短体的EspB均不能在细菌培养液中检测到ESAT-6/CFP-10。 通过联合使用X-ray和冷冻电镜对EspB结构进行解析,并利用耻垢分支杆菌作为模式生物来检测结构分析的正确性,我们证明EspB作为一个动态孔道,调节ESAT-6/CFP-10的分泌情况。