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随着DNA重组技术应用于抗体的改造,出现了人源化鼠单抗、小分子抗体、抗体融合蛋白等各种各样的基因工程抗体,极大推进了抗体在临床上的应用。但与天然的人抗体分子相比,小分子抗体结构不完整,无法发挥Fc段介导的各种生物学效应;人源化鼠单抗则不能完全消除抗体的异源性,仍会产生不同程度的HAMA,且亲和力较低,而目前尚无一套成熟的可表达人完整抗体的表达体系。因此本研究针对以上问题,选择了兼具原核系统良好操作性和真核系统后加工性的毕赤酵母表达体系进行构建和改良,以期建立一套可克隆、表达天然人完整抗体的真核表达体系。我们应用基因重组技术,在毕赤酵母表达载体pPICZα基础上构建完成了完整人抗体表达载体pPICZαIgG,并利用PCR介导的定位突变技术对其进行改良,成功建立了完整人抗体表达体系。应用该表达体系构建重链(轻链)抗体表达文库,利用抗体的抗原特异结合活性从中筛选出具有良好临床应用前景的抗-HBs抗体,进一步在该体系中进行重组表达及发酵纯化,通过对重组蛋白的分析鉴定,评价毕赤酵母表达体系在全分子抗体克隆、筛选、表达及发酵等方面的作用,为治疗性单抗的开发研制提供理论和实验依据。一、完整人抗体表达体系的建立1.构建重链和轻链抗体的表达载体pPICZαIgH和pPICZαIgκ: <WP=114>利用基因重组技术,分别将人抗体重链和轻链恒定区cDNA重组至毕赤酵母表达载体pPICZα,构建出重链和轻链抗体的表达载体pPICZαIgH和pPICZαIgκ。该载体内含有人抗体重链(轻链)恒定区cDNA,又在表达载体α信号肽3’末端引入了SalI(SpeI)位点,因此可将PCR扩增出的全套人抗体可变区cDNA(含酶切位点SalI+ApaI或 SpeI+CpoI)克隆到酵母天然α信号肽3’末端,与恒定区相接,构成可对重组抗体进行分泌表达的完整重链(轻链)抗体表达载体。2.构建完整人抗体表达载体pPICZαIgG:将分别克隆有轻链和重链恒定区cDNA的两个AOXI表达盒重组至同一载体,构成完整抗体表达载体。实验结果表明,该载体同时含有人抗体重链和轻链恒定区cDNA以及供可变区cDNA克隆的限制性内切酶位点,适合各种人源全分子抗体的克隆和表达。3.完整人抗体表达载体pPICZαIgG的改良:利用PCR介导的定位突变技术在AOXI表达盒3’末端引入新的酶切位点ClaI,结果证明该位点的引入可保证多个表达盒按同一方向进行重组,解决了表达盒串联时的方向性问题。同样应用该技术消除克隆有轻链恒定区cDNA的表达盒中已有的PmeI位点,保留另一个PmeI位点(含有重链恒定区cDNA的表达盒),使这种多拷贝载体可以线性化转化,更适合毕赤酵母表达体系的需要。实验结果表明线性化的完整抗体表达载体整合效率明显提高。因此,该改建后的表达体系除用于表达完整抗体外,也适用于其它蛋白的多拷贝表达,以提高重组蛋白的产量。4.完整人抗体表达体系的鉴定:扩增人抗体重链和轻链可变区cDNA,将其克隆到人重链、轻链及完整人抗体表达载体,建立相应的毕赤酵母表达体系。挑取转化子,甲醇诱导表达,应用免疫印迹技术对培养上清进行分析。结果分别在相应重链(55KD)、轻链(23KD)和完整抗体(140KD)的位置出现染色区带,说明该表达体系可对完整重链、轻链抗体及人源全分子抗体进行分泌表达,我们对其进行的一系列改造(多个酶切位点的引入或消除),只增加了新的生物活性,而对载体原有功能并无影响。 <WP=115>二.人抗乙肝表面抗体的筛选1.构建天然抗体表达文库:以HBsAg免疫后个体淋巴细胞为材料,扩增全套人VH和VκcDNA。经相应内切酶消化后重组至重链和轻链抗体表达载体pPICZαIgH和pPICZαIgκ,建成重链(轻链)抗体的表达文库。随机挑取10个克隆测序,均为不同序列,证明该文库具有良好的多样性。2.筛选抗-HBs抗体:从构建的文库中挑取多个克隆诱导表达,应用抗-HBs抗体检测试纸对不同克隆培养上清进行初步筛选,再经ELISA反应对阳性克隆进行生物活性鉴定,分别获得了抗-HBs抗体阳性的轻链及重链克隆。对其可变区DNA进行序列分析,同源比较结果,Vκ和VH均未见高同源序列发表,Vκ与已发表序列中同源性最高的Clone305-51L Vκ序列(Genbank AB027444)比较,氨基酸序列只有88%同源性,尤其CDR3区变异较大;而VH的CDR3区由23个氨基酸构成,尚未见同类序列发表。因此,我们筛选获得了新的具有HBsAg结合活性的抗体序列。结果提示我们建立的表达体系虽然其克隆能力远低于现在广泛应用于抗体筛选的噬菌体文库,库容相对较小,但它可以对完整轻链(重链)抗体及全分子抗体进行分泌表达,其强大的表达能力又是噬菌体文库所不能比拟的,因此有利于利用抗体的抗原特异结合活性来筛选所需目的基因。由于乙肝病毒是能够获得体内免疫的抗原,而我们选择了抗-HBs抗体阳性淋巴细胞作为材料来构建文库,被免疫者的淋巴细胞已在体内经过抗原选择和亲和力成熟过程,因此从较小库容的抗体库就能较容易的筛选到特异性强的高亲和力抗体。 三.重组人抗乙肝表面抗体的表达应用基因重组技术,将筛选获得的抗-HBs抗体cDNA重组到已构建的完整人抗体表达载体pPICZαIgG,线性化后转化毕赤酵母感受态细