1研究背景神经退行性疾病或神经系统损伤是一类以神经系统结构损伤和功能障碍进行性发展为特征的疾病,包括阿尔茨海默病,肌萎缩侧索硬化,血管性痴呆,帕金森病和中风等。有关大脑的研究是医学研究的前沿尖端领域。美国2013年启动了“脑计划”（BRAIN Initiative）,中国拟投资数百亿推动“2030脑科学与类脑研究”（Brain Science and Brain-Like Intelligence Technology）。全球政府和医学界对脑科学研究的高度重视,由此可见一斑。“脑神经血管单元”（Neurovascular Unit,NVU）是体现大脑结构与功能稳态与整体性的基本单位,主要包括“血管部分”（内皮细胞、周细胞、基底膜）、“神经部分”（神经元和多种胶质细胞）及胞外基质等,是神经系统疾病或损伤病理过程中的核心结构。对于疾病研究而言,体外实验载体是疾病病理机制临床前研究及药物筛选的必要平台。因此,用NVU主要组成细胞类型,构建具有整体结构与功能的体外NVU研究载体,对中枢神经系统退行性疾病或损伤研究及其相应药物筛选、药理作用机制探索都具有重要意义。本课题组长期致力于“脑神经血管内单元体外模型”的研究,此前成功构建了基于“Transwell”的“NVU体外二维模型”。本文在前期研究工作的基础上,自主创建了“NVU体外三维模型"及其“氧糖剥夺NVU体外三维模型”,并对“氧糖剥夺NVU体外三维模型”作为病理研究载体和药理研究载体的适用性进行了评价。本项目的研究得到了中央高校基本科研业务费（XDJK2020D037）和重庆市研究生科研创新项目（CYS18098）的支持。2研究目的构建具有血管样结构和多种神经细胞的“脑神经血管单元体外三维模型”及其氧糖剥夺损伤模型;评价“氧糖剥夺损伤脑神经血管单元体外三维模型”的病理研究适用性及药理研究应用适用性3方法与结果3.1脑神经血管单元体外三维模型的构建方法（1）分别以新生24 h大鼠海马区与新生10 d大鼠大脑皮层分离培养神经干细胞与微血管内皮细胞,并分别以Nestin/SOX-2和CD31免疫荧光染色进行细胞类型鉴定。（2）将微血管内皮细胞与神经干细胞按10:1比例混匀,再与基质胶（Matrigel）混合,使微血管内皮细胞的终密度为2×10~6·m L-1。采用神经分化培养基(DMEM/F12:Neurobasal 1:1,1%FBS,2%B27,20 ng·m L-1 rh EGF,10 ng·m L-1rh b FGF)培养7 d诱导微血管内皮细胞血管样结构的形成以及神经干细胞的分化。结果（1）原代培养的神经干细胞边缘规整,透亮,悬浮培养下成球状聚集,免疫荧光染色为SOX-2和Nestin阳性。而原代培养的微血管内皮细胞为纺锤型,成铺路石样排列,免疫荧光染色呈CD31,OCCLUDIN及ZO-1阳性。（2）在共培养后第1 d,血管内皮细胞迁移,出芽,延申并互相连接,而神经干细胞开始出现分化;在共培养第3 d,相互连接的血管样结构大体形成,神经干细胞迁移至内皮细胞附近并围绕血管样结构继续分化;在共培养的第7 d,共培养系统中出现清晰、复杂的网状血管样结构,构成“血管部分”,并与神经干细胞分化来的细胞所构成的“神经部分”（神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞）相互围绕构成结构单元。以上结果提示“脑神经血管单元体外三维模型”成型。3.2脑神经血管单元体外三维模型的结构表征及功能鉴定方法（1）共培养7 d后用免疫荧光和免疫蛋白印迹观察血管样结构（CD31）、神经细胞类型标记蛋白的表达,包括神经元（β3-tubulin）,星形胶质细胞（GFAP）,少突胶质细胞（MBP）,表征共培养体的结构形态并与同类细胞单独培养相比较。（2）共培养7 d后采用膜片钳记录神经元电生理、活细胞/死细胞染色检测细胞死亡率、ELISA检测VEGF和BDNF等相关因子水平,观察共培养体的细胞活性。结果（1）结构形态表征显示,共培养系统中与星形胶质细胞接触紧密的脑微血管内皮细胞形成相互连接的网状血管样结构,构成神经血管单元的“血管部分”;而神经干细胞分化而来的细胞组成神经血管单元的“神经部分”:共培养系统中神经元胞体饱满且具备立体感,轴突相互连接构成紧密神经网络;神经元与星形胶质细胞,少突胶质细胞交错分布在血管样结构周围。这些“自组织”形成的三维血管网络与神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞在结构上具有与体内类似的空间结构关系（如星形胶质细胞与血管接触面的足突结构）。共聚焦三维重建结果显示血管样结构与神经元和星形胶质细胞交错缠绕形成三维结构单元,证明我们构建的脑神经血管单元模型与体内脑神经血管单元具有结构相似性;（2）功能鉴定显示,与单独培养相比,共培养系统中具有更典型的神经元动作电位和更高的发生率;细胞的凋亡率与死亡率均显著降低,相关营养因子VEGF、ANG-1、BDNF、NT-3、NGF、GDNF、CNTF的表达水平显著升高。以上结果提示“脑神经血管单元体外三维模型”构建成功。3.3脑神经血管单元体外三维模型的体内移植试验方法复制局灶性脑缺血模型大鼠,在第1 d进行改良神经功能缺损（m NSS）评分判定模型成功后（＞4分）再将三维脑神经血管单元移植到脑缺血大鼠的梗死灶,第14 d时分别采用改良神经功能缺损评分、TTC染色或免疫荧光检测其对脑缺血大鼠神经功能、脑梗死体积和血管新生、神经再生的改善情况。结果将三维脑神经血管单元移植到脑缺血模型大鼠梗死侧后,与模型组相比,梗死侧的血管密度与神经元密度均升高,脑梗死体积与神经功能缺损评分均减少,说明三维脑神经血管单元能够促进脑缺血大鼠梗死侧的血管新生与神经新生,降低脑梗死体积,改善脑缺血大鼠神经功能缺损,证明我们所构建的三维脑神经血管单元具备体内活性与功能性。3.4氧糖剥夺神经血管单元三维模型的构建及神经血管保护剂效果验证方法（1）将三维脑神经血管单元在氧糖剥夺（Oxygen glucose deprivation,OGD）条件下培养8 h,构建OGD损伤三维脑神经血管单元模型,以细胞增殖降低、神经血管结构损伤等作为模型成功主要判定标准。（2）采用免疫荧光和Ed U染色观察神经元形态、血管样结构和细胞增殖,评价兼具神经和血管保护作用的工具药物VEGF对OGD损伤的三维脑神经血管单元中神经部分与血管部分的保护作用。（3）检测活性氧、超氧化物阴离子、超氧化物歧化酶、丙二醛和一氧化氮等的表达水平以及乳酸脱氢酶漏出率,从氧化应激的角度观察工具药物临床脑保护剂依达拉奉（Edaravone）对OGD损伤的三维脑神经血管单元的改善作用。结果（1）与正常组相比,“OGD三维脑神经血管单元”组血管样结构形态严重受损,神经元轴突长度显著降低;而氧化应激相关指标如活性氧,超氧化物阴离子,丙二醛,一氧化氮水平以及乳酸脱氢酶漏出率显著升高,超氧化物歧化酶活性显著下降,细胞凋亡率增加,证明病理损伤模型构建成功。（2）与“OGD三维脑神经血管单元”组相比,血管神经促进剂VEGF组血管新生与神经新生显著增强,血管样结构紊乱显著减轻,神经元轴突长度显著升高。（3）神经保护剂Edaravone组超氧化物歧化酶活性显著升高,活性氧,超氧化物阴离子,丙二醛,一氧化氮水平以及乳酸脱氢酶漏出率,细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05）。以上结果提示“OGD三维脑神经血管单元”具备脑缺血的神经、血管、氧化应激损伤特征,且能被VEGF或Edaravone改善,具备病理研究适用性。3.5梓醇对体外氧糖剥夺三维脑神经血管单元的保护作用及与体内水平比较方法（1）按第四章方法构建OGD损伤的三维脑神经血管单元模型,予以25,50,100 n M梓醇后检测CD31,β3-tubulin,GFAP,ZO-1,超氧化物阴离子,VEGF-VEGFR2通路蛋白VEGF,p-VEGFR2/VEGFR2,PI3K,p-AKT/AKT,FAK,p-Paxillin/Paxillin,MEK1/2,ERK1/2表达。（2）按第三章方法复制局灶性脑缺血大鼠模型,予以2.5,5.0,10.0 mg·Kg-1梓醇后进行神经功能缺损评分,并采用TTC染色检测脑梗死体积,免疫荧光及免疫蛋白印迹观察VEGF-VEGFR2通路蛋白VEGF,p-VEGFR2/VEGFR2,PI3K,p-AKT/AKT,FAK,p-Paxillin/Paxillin,MEK1/2,ERK1/2表达。（3）比较梓醇对OGD三维脑神经血管单元及脑缺血大鼠神经血管单元保护作用的相似性,包括NVU整体结构、血管结构、神经元形态等。结果（1）在体外,与正常组相比,“OGD三维脑神经血管单元”组细胞死亡率显著增加,血管样结构明显损伤,紧密连接蛋白ZO-1的表达显著降低,荧光素钠的渗漏率显著升高,神经新生减弱,神经元轴突长度显著降低,脑神经血管单元整体结构明显损伤;与“OGD三维脑神经血管单元”组相比,梓醇组细胞死亡率显著减少,血管样结构损伤减轻,紧密连接蛋白ZO-1的表达显著提高,荧光素钠的渗漏率显著降低,神经新生加强,神经元轴突长度显著增加,脑神经血管单元整体结构损伤显著改善。（2）而在体内,与正常组相比,脑缺血大鼠神经功能缺损评分与脑梗死体积显著升高,组织具有明显病理损伤,大脑皮层和室管膜下区/海马齿状回颗粒下层区域的血管新生、神经新生均受到抑制,神经元轴突长度显著降低,脑神经血管单元整体结构紊乱;与模型组相比,梓醇组脑缺血大鼠神经功能缺损评分与脑梗死体积显著降低,组织病理损伤减轻,大脑皮层或室管膜下区/海马齿状回颗粒下层区域的血管新生或神经新生及神经元轴突长度显著增加,脑神经血管单元整体结构完整性增强。（3）在机制方面,与“OGD三维脑神经血管单元”组相比,梓醇组中VEGF的表达显著升高,进而激活其下游通路FAK-Paxillin,PI3K-AKT,MEK1/2/ERK1/2,且该激活作用以及对血管结构和神经元的保护作用能够被相应的通路抑制剂SU1498,LY294002或PD98059所抑制,说明梓醇对OGD损伤的三维脑神经血管单元的保护作用与激活VEGF-PI3K/AKT及VEGF-MEK1/2/ERK1/2通路相关。而在体内,与模型组相比,梓醇组大鼠脑梗死侧皮层VEGF,p-VEGFR2/VEGFR2,PI3K,p-AKT/AKT,FAK,p-PAX/PAX,MEK1/2,ERK1/2,p-ERK1/2表达量均显著升高,说明梓醇发挥血管与神经保护作用,继而保护脑缺血大鼠脑神经血管单元同样与提高VEGF表达,继而激活PI3K/AKT与MEK1/2/ERK1/2信号通路有关。上述结果表明梓醇对体外三维脑神经血管单元及体内脑神经血管单元兼具保护作用且其作用机制具有相似性。4研究结论（1）微血管内皮细胞与神经干细胞在基质胶的支持下“自组装”为结构有序的三维脑神经血管单元,与体内脑神经血管单元具有结构与功能相似性。提示脑神经血管单元体外三维模型构建成功;（2）脑缺血大鼠接受脑神经血管单元体外三维模型移植后,梗死侧的血管新生与神经再生增强,脑缺血大鼠神经功能缺损改善,证明我们所构建的三维脑神经血管单元具备体内活性与功能性;（3）氧糖剥夺损伤的三维神经血管单元模型具有类似于脑缺血造成的病理损伤,并可被VEGF或Edaravone所改善;体内外试验共同证明梓醇对氧糖剥夺损伤三维神经血管单元的改善作用与其在体试验结果具有一致性;以上表明该模型适于脑缺血中神经血管单元损伤病理机制研究及其潜在治疗药物的体外评价,具备病理及药理研究适用性。