拟南芥叶绿体TAC复合物相互作用网络的构建

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Pfalz等人从拟南芥以及芥菜中纯化出染色体转录激活复合物(Transcriptional Active Chromosome,TAC)并用质谱法鉴定出35个成员;但是,目前对这些成员之间的物理上的相互关系并不清楚。本文主要通过酵母双杂交的方法研究了拟南芥叶绿体TAC复合物35个成员之间相互作用。首先,通过之前的研究文献我们先确定了TAC复合物的35成员,然后对35个成员进行克隆,分别将这些成员去除前导肽的编码序列构建到酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7,并将重组的pGADT7质粒混合形成一个猎物质粒库。随后,我们利用每一个成员的重组pGBKT7质粒与这个猎物质粒库进行酵母双杂交实验。将筛选得到的阳性克隆进行菌落PCR,得到的PCR产物进行测序,找出相互作用成员的基因序列。通过以上过程,我们一共筛选到了135对相互作用的蛋白,涉及到30个蛋白质。其中5个蛋白质如 AtMurE(At1g63680),rpoB(Atcg00170),rpoC1(At00180),pTAC2(At1g74850),pTAC3(At3g04260)在库中没有筛选到任何一个蛋白与他们存在相互作用。pTAC7/pTAC14,FSD2/FSD3,TrxZ/FLN1,TrxZ/FLN2之间存在相互作用已经被之前的文献报道,我们的结果中也检测到了这四对相互作用。我们将所得的所有相互作用构建成一个网络。其中,与pTAC10相互作用的蛋白最多,有12个蛋白与其又相互作用,而RPL29,FSD2,pTAC11,这三个蛋白各自都只存在一个蛋白与它相互作用。pTAC6,pTAC12,pTAC14,FSD2,FSD3,FLN1,FLN2,TrxZ这些蛋白平均存在的相互作用的蛋白数要高于其他的蛋白,有趣的足这些基因的T-DNA插入的突变体都变现出黄化或是白化的表型。我们挑选了16对相互作用进行酵母双杂交的反向验证,有挑选了四对进行体外的Pull down实验的验证。此外,我们利用该猎物质粒库筛选一个参与调控质体基因表达的蛋白AtECB1,我们从中筛选到了pTAC9,TrxZ,pTAC18,FSD3,FLN1这五个蛋白与其存在相互作用,这个结果为我们研究ECB1的功能提供了分子基础。此项研究对拟南芥TAC复合物成员之间的相互关系进行了具体的阐述,同时我们构建的这个库会对以后研究与质体基因表达有关的未知蛋白的功能提供了很大的帮助。
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