目的:研究BTG1基因高表达对乳腺癌细胞的生长增殖、凋亡和浸润、转移、和放射敏感性影响及其相关作用机制,为BTG1作为新的预测乳腺癌发生和转移的新分子标志物、基因治疗的新靶点和在放射治疗调节中的作用提供临床前的理论基础和实验依据。方法:1、参照GeneBank中BTG1的基因序列,通过自行设计并扩增得到BTG1基因cDNA的引物一对,并构建携带人类全长BTG1 cDNA的pcDNA-BTG1真核表达载体;2、应用阳离子脂质体Lipofactamin2000介导将pcDNA-BTG1质粒转染到乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中,通过在含G418的培养基中培养筛选获得耐G418的克隆,最后采用RT-PCR和Western Blot法检测细胞克隆中BTG1的mRNA和蛋白表达水平,并对细胞的遗传稳定性进行鉴定。3、MTT法检测细胞的增殖活性;流式细胞仪法检测细胞周期分布和磷脂酰丝氨酸外翻法检测凋亡; Western blot方法检测细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白表达变化。4、细胞划痕法观察细胞体外迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭能力;Western blot检测细胞浸润转移相关蛋白的表达变化。5、皮下瘤液接种法建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型,观察BTG1对体内肿瘤组织细胞生长增殖的影响;用免疫组化法分析Bcl-2表达情况和TUNEL法检测肿瘤组织凋亡情况。6、皮下瘤液接种法建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型,观察BTG1在体内对肿瘤组织血管密度和血管数目,免疫组化法分析肿瘤微血管生成和VEGF表达情况。7、克隆形成法检测接受X射线照射后乳腺癌细胞存活分数,分析BTG1基因对乳腺癌细胞放射敏感性的影响。8、流式细胞仪法检测接受X射线照射后乳腺癌细胞周期分布和凋亡;Western blot方法检测细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白、DNA损伤修复、参与DSB的非同源末端连接修复途径的相关蛋白的表达变化。9、荧光定量PCR检测接受X射线照射后乳腺癌细胞BTG1和DNA损伤修复相关基因mRNA水平变化;彗星实验检测DNA损伤和修复情况;免疫荧光原位杂交法检测γH2AX的foci过程;荧光探针法检测γH2AX和ROS变化。10、染色体畸变分析检测接受X射线照射对乳腺癌细胞基因组稳定性的影响。11、皮下瘤液接种法建立乳腺癌荷瘤裸鼠模型,观察接受X射线照射后荷瘤裸鼠的体重、生存期和肿瘤生长的影响;免疫组化分析肿瘤血管分布、微血管生成和VEGF表达情况,检测肿瘤浸润转移的情况;免疫组化分析Bcl-2的表达和TUNLE末端染色法检测肿瘤坏死和凋亡的情况。结果:1、构建携带有全长BTG1 cDNA的pcDNA3真核表达载体,经过基因测序,证实pcDNA3-BTG1质粒构建成功。2、建立BTG1高表达的稳定转染乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞株,经检测BTG1基因的mRNA水平和蛋白水平显现高表达,且遗传性状稳定。3、与对照组细胞相比,转染BTG1基因的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞的生长速度减慢,细胞增殖能力降低;高BTG1表达的乳腺癌细胞中Cyclin D1、Cyclin B1和CyclinE1蛋白表达水平下降,细胞周期的G0/G1期细胞比例升高。4、与对照组细胞相比,BTG1高表达的乳腺癌细胞出现凋亡,Sub G1峰明显升高,磷脂酰丝氨酸外翻增多,细胞晚期凋亡明显;而且细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低,促凋亡蛋白Bax和caspase-3表达水平升高。5、BTG1高表达对乳腺癌荷瘤裸鼠模型体重无明显影响,但与对照组荷瘤裸鼠相比,接种BTG1高表达的MDA-MB-231/BTG1裸鼠模型的肿瘤生长率明显降低,平均瘤重和平均瘤体积均低,且肿瘤组织内瘤细胞密度减少。BTG1高表达的肿瘤组织内BTG1蛋白显高表达,但Bcl-2表达水平降低,并有的细胞出现核固缩、呈碎片状,不规则,大小不一致,即凋亡细胞出现。其它对照组裸鼠的肿瘤组织内未见凋亡细胞。6、与对照组细胞相比,转染BTG1基因的乳腺癌细胞划痕实验所产生的间隙较宽,Transwell侵袭实验穿过基质胶膜到达下层的细胞明显减少。转基因组细胞核转录因NF-κB、基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均低于对照组细胞,而E黏附蛋白表达水平则明显高于对照组细胞。7、荷MDA-MB-231/BTG1乳腺癌裸鼠模型,BTG1可抑制乳腺癌肝转移,肿瘤组织内血管密度明显降低,血管数目显著下降,VEGF呈现低水平表达。8、与各对照组细胞相比,BTG1高表达使乳腺癌细胞辐射照射后的存活分数显著下降,剂量-效应曲线左移,表现为细胞放射敏感性提高。9、与对照组细胞相比,转染BTG1基因的乳腺癌细胞受照后均出现G2/M期阻滞,S期细胞明显减少。BTG1基因高表达,使乳腺癌细胞受照后的细胞凋亡率增高,且随辐射剂量的增加而增加。10、与各对照组细胞相比,转染BTG1基因的乳腺癌细胞受到X-射线照射后, Cyclin D1、Cyclin B1、Cyclin E1、Bcl-2、磷酸化Akt蛋白表达水平降低,Bax、caspase-3和Bad表达水平上调,而NF-κB水平则未发生明显变化。另外,BTG1高表达细胞受照后,引起DNA损伤修复相关蛋白水平的变化,包括磷酸化P53水平上调,磷酸化ATM和磷酸化CHK2表达水平下调,但BRCA1、RAD51和MRE11表达未见明显改变。DSB的非同源末端连接修复途径的Ku-70、Ku-80、DNA-PKcs、XRCC4的表达水平下调,DNA-PKcs水平未见任何改变。11、与各对照组细胞相比, MCF-7/BTG1细胞受照射后BTG1 mRNA水平小幅升高,照射后1小时达到最高,随后在2-24小时内逐渐降低。与各对照组细胞相比, MCF-7/BTG1细胞中DNA连接酶ligaseⅣ的mRNA水平在照射后1小时达到最高,随后降低。12、与各对照组细胞相比, MDA-MB-231/BTG1和MCF-7/BTG1细胞受照后彗星尾长和尾距加大、尾部DNA含量增大,且显现照射剂量-效应关系;照后0h～24h DSB损伤及修复过程中,MDA-MB-231/BTG1和MCF-7/BTG1细胞的拖尾长度明显长,拖尾率以及DNA迁移到尾部的比例也明显高,且具有统计学意义。13、MCF-7/ BTG1细胞照射后γ-H2AX位点数明显高于对照组细胞,且具有统计学意义;而且γ-H2AX荧光强度也明显高于对照组细胞,具有显著差异。14、照射后MDA-MB-231/BTG1细胞内其ROS荧光强度明显高于对照组细胞,且具有统计学意义。15、与各对照组细胞相比,受照后BTG1高表达的乳腺癌细胞染色体畸变率增加。16、与各对照组动物相比,荷MDA-MB-231/ BTG1细胞荷瘤裸鼠受辐射治疗照射后体重最重,肿瘤生长率明显降低,平均瘤重和平均瘤体积均最低,生存期延长;荷MDA-MB-231/BTG1细胞荷瘤裸鼠受照后肿瘤细胞密度和血管密度最低,未见VEGF表达,Bcl-2显弱表达,并可见大量凋亡细胞。结论:1、提高转染pcDNA3-BTG1质粒可以提高乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中BTG1表达水平,而且BTG1外源基因可以在细胞中稳定、持续、高效地表达。2、BTG1高表达能明显抑制乳腺癌生长增殖、促进凋亡,其可能的机制与BTG1参与细胞周期调控、诱导细胞凋亡相关。3、BTG1高表达可抑制乳腺癌侵袭转移,其可能的机制与下调NF-κB、MMP-2、MMP-9的表达有关,还与抑制肿瘤血管生成、抑制VEGF生成相关。4、提高BTG1表达能提高乳腺肿瘤的放射敏感性,其机制可能与BTG1参与细胞周期调控、G2/M期阻滞、诱导细胞凋亡相关;与BTG1影响凋亡通路相关蛋白表达水平有关;与BTG1参与调控ATM通路、DNA损伤修复通路、DSB修复阻滞相关;与BTG1促进ROS生成,清除自由基相关。