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反义lncRNA是生物体内普遍存在的一种lncRNA形式,可以以顺式（cis）或反式（trans）作用的方式调控基因组中正义基因的表达。本实验室在前期研究中以白菜矮脚黄核不育两用系‘Bcajh97-01A/B’的花蕾为材料进行了转录组测序,并在花粉外壁发育重要调控基因MYB80的两个拷贝Br MYB80a和Br MYB80b所在的基因座位置上分别发现了一条反义lncRNA,将其各命名为Br MYB80a-ALNR（Br MYB80a-antisense long noncoding RNA）和Br MYB80b-ALNR（Br MYB80b-antisense long noncoding RNA）。数据库查询发现在拟南芥的At MYB80基因座类似位置也存在一条反义lncRNA,命名为At MYB80-ALNR（At MYB80-antisense long noncoding RNA）。推测MYB80基因座的天然反义转录本可以调控MYB80的表达,并以此作用于花粉外壁的形成。前期,我们以Ca MV35S启动子构建了表达载体,转化拟南芥初步验证了这3条反义lncRNA的功能,但鉴于Ca MV35S启动子在花粉中的表达效率较低,同时并不能代表基因本身的表达特点,为了确认lncRNA的功能及在不同物种中的保守性,并进一步探究它们与MYB80的关系及作用机制,本论文构建了自身启动子启动的Br MYB80a-ALNR和Br MYB80b-ALNR表达载体并获得转基因植株,以进一步确认它们在花粉外壁发育中的作用及对MYB80表达的调控作用;通过比较Br MYB80a-ALNR和Br MYB80b-ALNR异源表达植株与At MYB80-ALNR过表达植株表型的异同,确定白菜和拟南芥MYB80基因座上反义lncRNA是否具有功能保守性;利用转录组测序手段,分析MYB80基因座上反义lncRNA所参与的调控通路;利用RNA pull-down结合蛋白质谱分析,研究反义lncRNA是否可能与其他蛋白质互作而作用于基因表达的调控。论文取得以下主要结果:（1）构建了白菜自身启动子启动的Br MYB80a-ALNR和Br MYB80b-ALNR的表达载体并分别异源转化至拟南芥,获得了转基因植株。亚历山大染色结果表明转基因植株的花粉活力正常。对转基因植株抽薹时的生长天数和莲座叶片数进行了统计,发现转基因植株提前抽薹。对花粉进行扫描电镜观察发现转基因植株的花粉出现了外壁部分区域光滑和顶盖层发育不正常的现象。（2）对白菜Br MYB80a-ALNR和Br MYB80b-ALNR以及拟南芥中的At MYB80-ALNR进行了序列同源性比对,结果显示三条lncRNA前端部位有一段约700 bp的高度相似序列,以及在后端有一段约120 bp的高度相似序列。克隆出了At MYB80基因的启动子片段并通过洋葱表皮瞬时转化实验验证了其启动活性。构建了At MYB80基因启动子启动的At MYB80-ALNR过表达载体并转化拟南芥获得了过表达植株。观察到过表达植株都出现了较严重的败育,具体表现为角果不发育,呈现短缩态,果荚内没有种子。用对照植株的花粉对转基因植株进行授粉,角果发育正常,说明转基因植株雌蕊发育正常,不育现象缘由于花粉的败育。对花药进行亚历山大染色,结果显示过表达植株花药中一半花粉的活力异常。扫描电镜结果显示,转基因植株成熟花粉外壁外层完全缺失,花粉粒呈现塌缩态,花粉数量显著减少。对不同发育时期的花药进行半薄切片观察,发现过表达植株的花粉从单核期开始出现了形态异常,花粉外壁变薄,成熟花粉数量减少。透射电镜结果显示,花粉外壁的基粒棒和顶盖层完全缺失,呈光滑的状态,花粉细胞质较之对照也发生了提早降解。统计了过表达植株抽薹时的生长天数和莲座叶片数,发现过表达植株的抽薹时间显著提前。（3）对At MYB80基因启动子启动的At MYB80-ALNR过表达植株及对照花序进行转录组分析,共发掘新基因451个,其中295个得到功能注释。根据基因在不同样品中的表达量,共筛选到差异表达基因2172个,其中819个基因在转基因植株中上调表达,1353个基因下调表达。进一步分析发现与花粉壁发育的相关代谢物质途径中富集的基因表达下调,比如苯丙烷代谢。细胞分裂素合成途径中的基因表达量下降。MYB80下游基因（VGD1、GLOX1、UND、MS1）、与MYB80可能存在互作关系的基因（LAP5/6、NAC010、NST1、KNAT7）、胼胝质沉积及降解相关基因（CALS5、A6）、孢粉素合成基因（CYP703A2）及含油层堆积相关基因（GRP14/18/20、EXL4/6、BGLU20、LACS5）的表达量都下降,说明At MYB80-ALNR过表达引起了花粉壁发育的异常。（4）用体外转录的方法获得了At MYB80-ALNR序列,并通过RNA pull-down实验获取与其互作的蛋白,通过PAGE胶进行初步鉴定,结合质谱实验分析发现共计1157个蛋白,其中正义序列组独有蛋白25个,正义-反义序列组共有蛋白1069个。初步筛选到4个候选蛋白可作为后续研究MYB80-ALNR作用机制的互作蛋白。