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研究背景铁是人体必需的微量元素,在人体许多生理过程中发挥作用,它还参与形成氧转运存储分子,如血红蛋白和肌红蛋白。铁缺乏导致贫血,铁过载导致遗传性血色素沉着症。铁调素是由肝脏合成和分泌的小分子多肽类激素,它在铁稳态代谢调控中起着主要作用。在人体内,铁调素与哺乳动物铁外排蛋白ferroportin(FPN)结合,使其内化和降解,随后小肠铁吸收被抑制,同时肝脏铁动员和巨噬细胞铁外排也被抑制。铁调素会响应炎症和高铁而被上调,而当体内促红细胞生成素增多、铁缺乏和缺氧状态时,铁调素会被下调。因此,铁调素产生不足与铁超载疾病相关,如遗传性血色素沉着症和地中海贫血。所以,铁调素被当作一个治疗铁过载疾病的有潜力的靶点。例如,迷你铁调素(mini-hepcidin),一种铁调素的衍生物,可以降低Hbbth3/+小鼠(一种经典的β-地中海贫血模型)的铁水平。铁调素主要受BMP/SMAD信号通路调控,这条通路上的Hfe、Hjv、Tfr2突变以及下游Hamp、Fpn突变均可以导致人类遗传性血色素沉着症。铁调素表达同时也被炎症因子IL-6激活的磷酸化JAK2/STAT3信号通路调控。近年的研究表明维生素A、D、E、C通过调控铁调素对铁代谢产生影响。维生素A缺乏的饲料饲喂大鼠,使肝脏铁调素表达和血清铁降低,同时脾脏铁升高。维生素D处理体外培养的肝细胞系,Real-time PCR结果显示铁调素下调0.5倍。在一项临床预备实验中发现,24小时内补充维生素D,血清中铁调素下降34%。小鼠中,维生素E可以阻断酒精调控的肝脏铁调素下调和小肠DMT1上调。在人源性肝癌细胞系(HepG2细胞系)中发现,维生素C可以抑制铁调素的表达。这些研究提示维生素和铁代谢之间可能存在相互影响,而其具体的分子机制尚不十分清楚。研究目的(1)系统性筛选维生素,发现新的更有效安全的铁调素调控剂。(2)深入探究维生素B4(腺嘌呤)调控铁调素的分子机制,丰富铁调素分子调控网络。材料与方法药品所有的维生素和8-Br-cAMP购买自Sigma化学药品公司,重组人BMP6购买自R&D公司,LDN193189、U0126和H89购买自Selleck化学药品公司。动物8周龄C57/BL6雄鼠购买在上海生命科学研究院动物中心,饲养在浙江大学动物中心SPF级饲养室,AIN-76A标准饲料(Research Diet公司)喂养。实验组小鼠饲喂含0.2%(w/w)维生素B4(腺嘌呤)的饲料,对照组饲喂AIN-76A标准饲料,麻醉处死小鼠,取组织和全血用于后续实验。另一实验中,选取4周龄Hfe-/-小鼠,实验组饲喂含0.1%(w/w)维生素B4(腺嘌呤)饲料30天和60天,对照组饲喂相应天数的AIN-76A标准饲料。每个实验组包含10只小鼠。Western blot分析RIPA法提取细胞和组织蛋白,BCA法测蛋白浓度。所用抗体pSMAD1/5/8、SMAD1、pSTAT3、STAT3、pERK1/2、ERK1/2购自CST公司,1:1000稀释使用;GAPDH抗体购自Sigma公司,1:2000稀释使用。荧光定量PCR使用罗氏480仪器检测Hamp、Tfr1、BMP6和EPO的表达,HPRT作为内参。铁指标检测检测小鼠血清铁、血清转铁蛋白饱和度和组织铁水平。数据分析定量数据均以均数±标准差表示,两组之间比较采用独立样本的t检验;多组之间比较采用one-way ANOVA检验及q检验。设P<0.05为有统计学意义。结果我们以铁调素为靶点的无偏倚的维生素筛选实验发现,维生素B4(腺嘌呤)是潜在的铁调素激动剂。体外细胞实验,维生素B4(腺嘌呤)通过BMP/SMAD通路和MAPK/ERK通路显著上调铁调素mRNA表达和启动子活性。这个结果在小鼠实验中得到进一步的验证:与饲喂普通饲料小鼠相比,饲喂含0.2%(w/w)维生素B4(腺嘌呤)饲料可以显著上调小鼠肝脏铁调素的表达,其BMP/SMAD通路和MAPK/ERK通路同时也被激活。更为重要的是,维生素B4(腺嘌呤)可以减轻高铁饲料诱导的野生型小鼠和Hfe-/-小鼠(一种经典的血色病小鼠模型)的铁负荷。为了进一步的探究维生素B4(腺嘌呤)上调铁调素的机制,我们选取BMP和ERK通路的特异性抑制剂——LDN193189和U0126进行实验。我们发现,分别加入LDN193189和U0126均可以大幅度阻断腺嘌呤激活铁调素,同时加入二者,铁调素的表达几乎完全被阻断。这个结果提示,维生素B4(腺嘌呤)激活铁调素必须依赖BMP/SMAD通路和MAPK/ERK通路。更深层次,我们通过cAMP的类似物8-Br-cAMP和cAMP/PKA的拮抗剂H89处理Huh7细胞系和小鼠肝原代细胞发现,维生素B4(腺嘌呤)对上述两条通路的激活,是通过cAMP/PKA信号实现的。综上,维生素B4(腺嘌呤)或许成为治疗铁过载疾病的新手段。结论1、无偏倚的维生素筛选发现维生素B4(腺嘌呤)是潜在的铁调素激动剂。2、维生素B4(腺嘌呤)通过cAMP/PKA依赖的BMP/SMAD1/5/8和MEK/ERK1/2通路激活铁调素。3、维生素B4(腺嘌呤)显著减轻Hfe-/-小鼠的铁蓄积。