研究背景及目的慢性。肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)是临床常见病、多发病和疑难病,目前全球成年人CKD的发病率高达8%～16%,而其知晓率却低于10%,而这些CKD患者中,1%～3%将转为终末期肾衰竭(End stage renal disease, ERSD)。由于较多CKD患者对早期防治和危险因素的控制不够重视,人口老龄化加速,慢性感染性疾病增多,高血压、糖尿病患病率提高,使得CKD及其引起的ERSD发病率逐年增加,而且预后差、费用高,给社会和家庭带来了沉重的经济负担,CKD已成为威胁人类健康的世界性难题。目前,临床主要治疗策略包括：控制血压,糖尿病病人控制血糖,降低蛋白尿,应用抗氧化剂,控制血脂,控制高同型半胱氨酸血症,纠正贫血,防治感染,防止低钾血症和高磷血症,纠正水电解质和酸碱平衡紊乱,控制饮食等,其治疗的主要作用机制为控制机体的炎症反应,降低氧化应激水平,抑制纤维化相关因子的表达,从而延缓CKD的持续进展。然而,现有的治疗手段主要以控制CKD危险因素,保护肾功能以及减少并发症为主,虽然基础病变已经静止,但肾脏功能仍持续减退,且为数众多的CKD病人无法承受长期治疗的昂贵医疗费用,因此,寻找一种有效的廉价保守疗法来改善CKD的症状,稳定残存肾功,推迟其进入“肾脏替代疗法”的时间和速度,提高患者生存质量,是临床医药工作者亟待解决的重大课题。中西医结合治疗在此方面具有独特的优势和潜力。本课题组研制的尿毒清颗粒剂正是在上述背景下研制而成,为我国本领域首个中药防治CKD进展的新药,因其较好的疗效与相对低廉的价格,使其连续多年占中国肾病口服中成药市场首位。针对尿毒清颗粒剂在生产与推广使用中存在的问题和不足,课题组在尿毒清颗粒研究基础上进行了尿毒清的二次开发研究,对原处方进行了精简重组而成复方黄甘(Huang Gan Formula, HGF),旨在进一步提高产品质量、提升疗效和明确作用机理。本课题组前期研究表明：在以腺嘌呤灌胃法制备的慢性肾衰大鼠模型中,证明复方黄甘能显著降低肌酐(Serum creatinine, Scr)、尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN)及抑制模型大鼠体内的氧化应激,延缓肾脏纤维化。本研究拟通过建立HPLC指纹图谱,并利用HPLC-QTOF/MS技术对复方黄甘的复杂化学成分进行定性和定量分析,在初步阐明复方中的物质基础之上,进一步采用5/6肾切除法构建CKD大鼠模型,确切复方黄甘的药效,并从体内和体外实验研究复方黄甘对Wnt/β-catenin信号通路的干预作用,初步探讨其抗肾脏纤维化的可能作用机制,为其临床治疗CKD提供新的思路和可靠的实验依据。方法(1)通过醇提和水提醇沉合并工艺,制备复方黄甘提取物。利用HPLC法检测10批次平行提取的复方黄甘以建立指纹图谱,并根据HPLC指纹图谱检测结果,导入中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”进行计算共有指纹峰的相似度。然后通过HPLC-QTOF/MS法对复方黄甘中主要成分进行定性分析,以对照标准品验证其定性结果,并通过建立HPLC标准曲线测定主成分的含量。(2)利用5/6肾切除法构建CKD大鼠模型,并于给药前(术后2周)检测5/6肾切除模型组与假手术组的血清Scr、BUN水平,检验模型是否成功。造模成功后,按体重分层随机区组法将实验大鼠分成8组,每组11～12只,分别为：模型组(Model)、尿毒清组(UCG)、氯沙坦组(Losartan)、复方黄甘低剂量组(HGF-L)、中剂量组(HGF-M)、高剂量组(HGF-H)、假手术组(Sham)和本底对照组(Background control, BC)。给药方法：尿毒清组给予3.6g/kg/d混悬液灌胃,氯沙坦组给予30 mg/kg/day,复方黄甘低、中、高剂量组分别给予3.6、7.2、14.4g/kg/d混悬液灌胃,低剂量组为临床等效剂量,每日给药2次。假手术组与模型组灌胃给予等体积蒸馏水,本底对照组给予中剂量复方黄甘混悬液,持续给药12周。 于末次给药后收集24h尿量,并通过麻醉后腹主动脉采血收集血清,采用全自动生化分析仪检测血清Scr、BUN、 24h尿蛋白定量(Urinary protein,UPr)、尿肌酐(Ucr)、总胆固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL)等生化指标。收集各实验组大鼠残余肾脏,纵向切开肾脏组织,取一半放入4%多聚甲醛固定液中,用作病理切片以及免疫组化检测。将另一半皮质部分分成3份,分别用于制备组织匀浆,测定肾组织中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)以及谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)含量。另2份,于-80℃冻存,用于RT-PCR和western blot等实验。(3)取药效实验部分大鼠肾组织,分别提取组织中RNA与总蛋白。用RT-PCR技术检测Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl mRNA表达量,再利用western blot方法检测以上蛋白在各实验组大鼠肾组织的表达。用石蜡包埋法制备肾组织切片,通过免疫组织化学法观察Wnt1、β-catenin, Tcf4、Gsk-3p、 Dkk1以及Fnl蛋白在肾组织的表达部位,并对其表达量进行半定量分析。(4)HK-2细胞上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)模型的构建：利用高糖培养液(D-葡萄糖30mmol/L)分别诱导HK-2细胞12、24、48h,并以普通培养液和甘露醇等渗培养液作为对照,用western blot检测α-肌动蛋白(Alpha smooth muscle actin, a-SMA)和P-catenin蛋白的表达。用不同浓度复方黄甘作用HK-2细胞48h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死的比例,筛选复方黄甘最大安全浓度。Wnt通路相关蛋白的表达检测：实验分组为正常对照组(NC组),葡萄糖浓度5.5mmol/L的2%FBS培养液；②高糖模型组(HG组),葡萄糖浓度30mmol/L的2%FBS培养液；③高糖配制的复方黄甘干预组HGF100 (100μg/ml,低剂量组)和HGF200 (200μg/ml,高剂量组)；④ICG-001阳性对照组(10μM)；将各组细胞分别培养12h、24h、48h后,收集细胞,用RT-PCR和western blot检测Wntl、β-catenin、Tctf4、α-SMA、Fnl蛋白mRNA和蛋白的表达。制作细胞爬片,通过上述相同处理后,通过细胞免疫荧光在共聚焦显微镜下观察β-catenin与p-SMA的表达。结果1.复方黄甘物质基础研究(1)经提取干燥后复方黄甘1g浸膏相当于4.6g原药材。采用PDA检测器在200～400nm全波长扫描,发现复方黄甘在254nm处有最大吸收,特征峰明显且峰型与分离度都较好。采用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”,根据10批次样本的HPLC图谱生成对照指纹图谱,共标示出21个共有峰,共有峰的面积占总面积93%以上。各批次指纹图谱的相似度分别为：0.929,0.987,0.982,0.965,0.993,0.974,0.994,0.997,0.942,0.981,相似度均大于0.92,说明10批次复方黄甘具有较好的一致性,提取方法稳定,利用紫外HPLC指纹图谱能较好的控制复方黄甘整体质量。(2)采用HPLC-QTOF/MS检测分析,从质谱总离子流图中通过自动寻找和手动匹配的方法,共得到38种响应化合物,其中以正离子模式11个化学成分,负离子模式27个化学成分。通过与标准品的色谱保留时间对比分析及质谱分子离子峰与碎片峰对比分析确定,主要的8种化合物分别为甘草苷(liquiritin)、射干苷(tectoridin)、木樨草素(luteolin)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄酸(rhein)、大黄素(emodin)、大黄酚(chrysophanol)、大黄素甲醚(physcion)。(3)用HPLC标准曲线法测得复方黄甘中主要8各成分的含量分别为：甘草苷(0.167%)、射干苷(1.98%)、木樨草素(1.03%)、芦荟大黄素(3.78%)、大黄酸(3.13%)、大黄素(1.54%)、大黄酚(2.72%)、大黄素甲醚(1.55%)。2.复方黄甘药效学研究(1)造模2周后,肾切除大鼠Scr与BUN水平都显著高于假手术组(P<0.001),提示造模成功。给药期间,各实验组大鼠的体重无显著性差异,且呈逐渐上升趋势。(2)血清生化指标：各实验组数据均符合正态分布,采用单因素方差分析进行组间的多重比较。统计结果显示：给药12周后,模型组大鼠肾脏指数(RI)、 Scr、BUN、UPr都显著高于假手术组和本底对照组(P<0.01),肌酐清除率(Ccr)显著低于假手术组和本底对照组(P<0.05)。假手术组和本底对照组之间各项生化指标均无显著性差异(P>0.05)。各实验组大鼠间RI、Scr、BUN、Ccr、 UPr水平均有显著性差异(F=4.044, P=0.001; F=58.951, P< 0.001; F=114.147, P <0.001; F=4.113, P=0.001; F=6.108, P<0.001):各给药组RI均显著低于模型组(P<0.001),复方黄甘中、高剂量组BUN均显著低于模型组(P<0.05),且其三个剂量组均显著低于氯沙坦组(P<0.01),中、高剂量组Scr显著低于模型组(P<0.05),复方黄甘低高剂量组Ccr水平均显著高于模型组与氯沙坦组(P<0.05),而复方黄甘低、中、高剂量组UPr显著低于模型组(P<0.05),但低、高剂量组高于氯沙坦组(P<0.01)。复方黄甘三个剂量组RI、Scr、BUN、Ccr、UPr水平与尿毒清组均无显著性差异(P>0.05)。(3)各个给药组CHOL与LDL均显著低于模型组(P<0.05),但除了氯沙坦组的CHOL水平(P=0.971)。复方黄甘低、中、高剂量组均能降低肾组织中MDA水平、升高SOD、T-AOC、CAT以及GSH-PX,与模型组均有统计学差异(P<0.05)。血清AOPP水平复方黄甘低、中、高剂量组都显著低于模型组(P<0.001),且中、高剂量组显著低于尿毒清组(P<0.001)与氯沙坦组(P<0.01)。(4)HE与Masson染色结果显示：术后15周,假手术组与本底对照组大鼠肾组织未见明显病理改变。复方黄甘组炎性细胞浸润、小管萎缩、肾小球硬化与间质纤维化等症状都有明显的不同程度的减轻。3.复方黄甘对CKD大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路的影响(1) RT-PCR结果显示：各实验组大鼠肾组织Wntl,β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、 Dkkl以及Fnl mRNA表达水平差异均有统计学意义(F=3.784, P=0.004; F=9.140, P<0.001; F=9.781, P<0.001;F=7.004, P<0.001; F=8.059, P<0.001; F=2.858, P=0.021)。复方黄甘低、中、高剂量组均显著抑制Wnt1、β-catenin、 Tcf4以及Fnl mRNA的表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。同时,与假手术组和本底对照比较,复方黄甘三个剂量组均能上调Gsk-3β与Dkk1 mRNA水平(P<0.01,P<0.05))。(2) Western blot蛋白表达结果与RT-PCR结果相吻合：与模型组比较,复方黄甘低、中、高剂量组都显著抑制Wnt1 (P<0.001)、β-catenin (P<0.05)、 Tcf4 (P<0.05)以及Fnl (P<0.001)蛋白的表达,且假手术组与本底对照组间Wnt1、β-catenin、Tcf4、Dkk1、Fn1蛋白以及Gsk-3β磷酸化水平均无显著性差异(P>0.05)。(3)免疫组化结果显示：Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1、以及Fnl蛋白在假手术组与模型组均有表达,但假手术组表达范围小、色泽浅,表达量相对较弱。Wnt1、Dkk1与Tcf4三种蛋白的表达部位相似,主要集中在肾小管上皮细胞以及肾小球系膜细胞,且在肾小球中表达更强。β-catenin与Gsk-3β则主要表达在肾小球系膜细胞与远曲小管上皮细胞中。而Fn1主要在肾小球系膜细胞、基底膜以及肾小管间质中表达,这正是构成小管间质纤维化的主要原因。而半定量的结果与RT-PCR和western blot结果大体一致。4.复方黄甘通过Wnt通路对HK-2细胞EMT的干预作用(1)复方黄甘对HK-2细胞作用48h后的最大安全浓度为200ug/ml。高糖诱导HK-2细胞12、24、48h后,EMT标志性蛋白a-SMA与Wnt通路关键蛋白P-catenin的表达逐渐升高,而甘露醇(HM)组与正常对照组(NC)在处理时间内,都无明显表达。说明高糖能诱导HK-2发生EMT,且能激活Wnt通路相关蛋白的表达,高糖高渗透压对目的蛋白的表达无影响。(2) RT-PCR检测结果显示：高糖诱导HK-2细胞12、24、48h,并同时给予药物处理,在12h前Wntl、β-catenin、Tcf4、α-SMA、Fn1 mRNA的表达都较弱,药物抑制作用不明显。在24～48h间,Wnt通路激活达到高峰。统计结果显示：高糖诱导HK-2细胞48h后,高糖模型组(HG) Wntl mRNA表达水平较正常组显著升高(P< 0.001), ICG-001阳性对照组能显著抑制其表达(vs. HGP< 0.001),复方黄甘高、低剂量组亦有此抑制表达的作用(P=0.01,P=0.02),且与ICG-001组无显著性差异(P=0.276,P=0.122),但复方黄甘高、低剂量组间无统计学差异(P=0.601)。而各个给药组对β-catenin、Tcf4、α-SMA, Fn1 mRNA的表达,均表现出了与Wnt1同样的抑制趋势,且差异有统计学意义(P<0.05)。(3) Western blot结果显示：高糖诱导HK-2细胞48h后,Wnt通路相关蛋白显著上调,α-SMA与Fn1分泌增多。ICG-001阳性对照与复方黄甘高、低剂量组均能抑制该通路相关蛋白的表达,降低HK-2细胞在EMT过程中分泌的α-SMA与Fn1,差异均有统计学意义。而在细胞免疫荧光实验中也同样证明,复方黄甘高、低剂量组均能降低α-SMA与β-catenin的表达。结论(1)复方黄甘提取物的制备方法稳定可靠,不同批次复方黄甘提取物具有较好的一致性,通过建立HPLC指纹图谱能较好的控制复方黄甘整体质量。(2)利用Q-TOF/MS与HPLC方法,解析并测定复方中主要成分及其含量,基本明确了复方黄甘作用的物质基础,提高了复方黄甘质量控制水平与标准。(3)复方黄甘能有效保护5/6肾切除大鼠残余肾功能,显著降低CKD模型大鼠血清Scr、BUN以及尿蛋白水平,并提高残肾组织滤过功能以及抗氧化应激能力,减轻肾脏纤维化水平,有效延缓CKD的进展。(4)复方黄甘可从mRNA与蛋白水平抑制5/6肾切除大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路的表达,可能因此而减轻肾脏纤维化。(5)复方黄甘能抑制高糖诱导的HK-2细胞中Wnt/β-catenin通路的激活,而复方黄甘阻止其EMT过程可能与抑制此通路有关。