目的溺死(drowning)是机械性窒息导致死亡的原因之一,由于液体媒介阻塞呼吸道(鼻和口)而引起的机体缺氧,二氧化碳潴留,最终因窒息死亡的过程。我国河道水网密集,在水中发现的尸体较多,广州地区每年在水中发现的尸体就可达上千具。而水中发现的尸体死亡原因可能有多种,如属于意外溺水死亡,也可能是自杀、他杀、死后抛尸入水伪造意外溺水死亡的刑事案件。因此,确定水中尸体是否是溺死是解决上述问题的关键。目前,国内外对判断水中尸体是否为溺死的方法一般根据尸表检查、尸体解剖以及相关实验室检查、硅藻检验等综合分析结果的基础上做出的判定。其中硅藻检验在溺死的诊断中一直被认为是诊断溺死不可缺少的方法,尤其是在有些案例中,由于外界因素的综合作用下,导致尸体腐败甚至白骨化,溺死征象的消失,尸表检查、尸体解剖等工作对于诊断溺死往往不能奏效,此时硅藻检验可为诊断水中尸体是否为溺死诊断提供有力的证据。随着法医学者对溺死诊断研究的深入,硅藻检验经过改良和发展,目前方法有很多种,包括提取硅藻时脏器消化方法的不同,分为化学消化法、物理消化法,以及硅藻提取后观察方法的不同包括多种类形态学观察方法,如光镜、电镜观察方法等,硅藻检验的形态学观察主要步骤是对水中尸体脏器样本进行不同的方法处理后通过离心或滤膜富集的方法收集硅藻,经过光镜或电镜直接观察硅藻的形态与种类来辅助诊断溺死及溺死地点。硅藻检验中最经典且使用范围最广泛的方法即是强酸消化法,因其所需设备经济,操作简单,易于普及,在许多基层单位得以使用,但此种方法的局限性是对脏器中的硅藻破坏性较大,在操作的过程中由于强酸加热沸腾较为危险,而且硅藻富集的离心过程中损失了一些体积较小的硅藻,操作环境开放,易污染,容易导致假阴性、假阳性结果。为弥补溺死尸体脏器中硅藻检验方法存在上述的不足,本课题组在前期建立的微波消解-真空抽滤-自动电镜扫描法大大增加了硅藻检验的特异性及灵敏度,操作安全,检材消解效率高,若对硅藻检验进行定量与定性分析可进行溺死地点的推断,在溺死诊断中已发挥重要作用。但同时该方法在强酸消化、微波消解的过程中破坏了缺少硅质外壳保护的蓝藻、绿藻等藻类,这些藻类经过研究证实同样存在溺死尸体脏器中,属于溺死相关藻类。近年来,除上述对硅藻进行形态学检查方法有所发展外,一些法医学者为给溺死诊断提供快速、灵敏的方法,分子生物学方法应用到溺死诊断中成为研究热点,有报道称使用针对在水域中存在且分布广泛绿藻、蓝藻等藻类基因的特异性引物来进行溺死诊断的研究,同时也有研究使用针对硅藻基因的特异性引物来检测溺死尸体脏器中的硅藻来诊断溺死。如1996年,Kane[1]等人使用针对单一门类的超微浮游生物蓝藻的引物来诊断溺死；2003年,Abe等使用针对编码硅藻EG1、EG2, SKI、SK2蛋白基因的特异性引物来诊断溺死；2013年,Tie J[3]等人使用针对蓝藻的16SrDNA片段特异性引物诊断溺死；2014年,余政梁[4]等人使用检测硅藻的SSU基因特异性引物来诊断溺。目前,上述使用PCR技术检测藻类DNA特异性片段的相关报道大多使用针对一种门类的藻类特异性引物来诊断溺死,不能同时扩增多种与溺死相关藻类(如硅藻、蓝藻、绿藻等)。本研究主要通过酶消化法联合MoBio强力土壤DNA提取试剂盒(PowerSoilTM DNA Isolation Kit)提取藻类DNA,可直接用于下游实验；选用针对蓝藻、硅藻、绿藻等多种藻类特异性引物,扩增藻类16SrDNA中V3,V4区特异性片段,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及PCR产物测序,验证引物特异性。微波消解-真空抽滤-电镜扫描法是一种可靠的灵敏度高、特异性强的硅藻形态学检验方法,检测溺死样本具有较高的阳性率,但在检验的过程中破坏了蓝藻、绿藻的溺死相关藻类。本研究使用针对多种随溺液进入体循环的溺死相关藻类16SrDNA的特异性引物,检测微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测过的案例样本,并与微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测结果作比较,希望通过联合使用两种方法在水中尸体样本中发现多种溺死相关藻类,为溺死诊断提供新的思路。本研究同时应用毛细管电泳检测溺死相关藻类16SrDNA基因,由于毛细管电泳法应用广泛、操作简单,在溺死鉴定中易普及推广,希望为溺死诊断提供一种新方法。方法实验材料(1)实验动物样本35只实验兔随机分为3组：生前入水组(溺死组)15只,死后入水组(空气栓塞致死后入水)15只,以及对照组(空气栓塞死后不作处理)5只；(2)水中尸体样本共64份包括20例微波消解-真空抽滤-自动电镜扫描法检测水中尸体硅藻阳性样本(58份样本,其中肺脏、肝脏、肾脏样本分别为18、20、20份),6份微波消解-真空抽滤-自动电镜扫描法检验的水中尸体阴性肝脏样本,同时记录案例样本的腐败程度。(3)引物特异性验证样本7种已知溺死相关的藻类(直链藻、菱形藻、针杆藻、舟形藻,铜绿微囊藻,小环藻,小球藻)及白色念珠菌(真菌)、肉毒梭状芽孢杆菌(细菌)样本,人基因组DNA、兔基因组DNA,用于验证引物特异性。DNA提取使用酶消化法与PowerSoilTM DNA Isolation Kit试剂盒提取组织样本(实验兔、人体案例组织),水样中的藻类DNA及引物特异性验证样本DNA。PCR产物的检测及检验方法的比较(1)使用PCR-聚丙烯酰氨凝胶电泳法(PCR-PAGE)检测各组实验兔脏器中溺死相关藻类DNA,比较3组实验兔各脏器之间藻类检出率(2)使用PCR-毛细管电泳法(PCR-CE)检测溺死组实验兔脏器中溺死相关藻类,比较PCR-PAGE与PCR-CE两种方法在检测溺死组实验兔PCR产物阳性率,记录并比较两种电泳方法检测PCR产物电泳过程中电泳前准备时间、电泳后结果分析时间,同时比较两种方法检测PCR产物的各自特点；(3)PCR-CE检测收集的微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测的水中尸体脏器硅藻阳性样本共58份,6份水中尸体硅藻阴性肝脏样本,同时记录每份样本中硅藻数量,将PCR-CE法与微波消解法结果进行比较。结果实验兔样本结果：PCR-PAGE法检测3组实验兔生前入水组肺检出率最高,肝、肾检出率次之,分别为100%,86%,86%；实验兔死后入水组肺、肝、肾检出率分别为13%,O%,0%；对照组肺、肝、肾藻类未检出。PCR-PAGE法检测生前入水组与死后入水组各种脏器中藻类检出率经统计学检验差异显著(P<0.05)。PCR-CE法检测溺死组实验兔肺脏、肝脏、肾脏藻类检出率分别为100%,86%,86%,PCR-PAGE与PCR-CE法检测溺死组实验兔结果相比,两者在肺脏、肝脏、肾脏之间具有相同的阳性率,不具统计学意义(P>0.05)；PCR-CE法与PCR-PAGE法检测PCR产物在电泳前准备用时及电泳结果后分析用时相比,明显少于PAGE电泳法(P<0.05),且操作更加方便、简洁,处理多份样本有较好优势,结果容易储存。水中尸体样本藻类检出率结果：PCR-CE法检测经微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测过的20例共58份水中尸体硅藻阳性样本藻类检出率分别为：肺脏检出率最高为100%,肝,肾次之,分别为60%,60%。PCR-CE法在肾脏、肝脏样本的藻类检出率与微波消解-真空抽滤-电镜扫描法(肺、肝、肾均为100%)相比,两种方法阳性率比较具有统计学差异(P<0.05),即微波消解-真空抽滤-电镜扫描法阳性率明显高于PCR-CE法,其中PCR-CE法检测腐败程度较高的肝脏、肾脏样本中不易检出藻类DNA；两种方法在肺脏之间藻类检出率不具有统计学差异(P>0.05)；通过对PCR-CE法检测的部分阳性样本进行测序表明,在硅藻含量较少的一些样本中同时存在蓝藻。PCR-CE法检测微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测后6份硅藻检验为阴性样本1份新鲜检材藻类检测为阳性,测序结果显示为蓝藻。引物特异性检测结果：PAGE法检测7种溺死相关藻类DNA(直链藻、菱形藻、针杆藻、舟形藻,铜绿微囊藻,小环藻,小球藻)检测结果为阳性；检测人基因组DNA、兔基因组DNA,白色念珠菌(真菌)DNA,肉毒梭状芽孢杆菌(细菌)DNA均为阴性。结论实验兔结果表明PCR-PAGE法检测溺死相关藻类16SrDNA基因片段可以区分生前入水和死后入水；2例死后入水组实验兔肺脏中检测结果为阳性可能由于水的压力作用下经呼吸道进入肺脏中所致,因此只有肺脏中含有藻类时,对于进行溺死诊断要谨慎。PCR-PAGE与PCR-CE法检测溺死实验兔结果相比,虽然两者具有相同的阳性率,但实验过程中PCR-CE法与PCR-PAGE法检测PCR产物相比,电泳前准备时间及电泳后结果分析时间均较为省时,且操作更加方便、简洁,结果容易储存等优点,对于处理多份样本有较好的优势。对20例水中尸体样本研究结果表明,较新鲜的检材使用PCE-CE法检测溺死相关藻类易检出,而腐败较为严重的检材不易检出,导致本方法检测案例尸体脏器样本中肝脏、肾脏中的藻类检出率低于微波消解-真空抽滤-电镜扫描法。使用PCE-CE法检测水中尸体案例样本研究表明,对一些水中尸体案例样本中硅藻检测数量含量较少(通过微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测记录脏器中硅藻数量)的样本,也含有其它的溺死相关藻类如蓝藻(通过对PCR-CE法检测为阳性的样本进行产物测序)。因此,通过PCR技术检测多种溺死相关藻类同时联合微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检验硅藻,有望为溺死的诊断提供可靠的信息,为溺死诊断提供新思路。