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Smac(secondmitochondrialactivator0fcaspase，即caspase的第二个线粒体激活因子)也被称为DIABLO(directIAPbindingproteinwithlowPI，即低等电点的IAP直接结合蛋白)，全长239个氨基酸，1～55位氨基酸是将其靶向线粒体的信号肽(MTSmitochondrialtargetingsequence)，而第56～239位氨基酸则编码成熟Smac，也被称为野生型Smac[28-30]。当凋亡发生时，成熟Smac和细胞色素c一起被线粒体释放入细胞质，Smac通过与凋亡抑制蛋白IAPs[31-35](inhibitapoptosisproteins)结合，参与caspase的激活及级联放大效应，从而加速凋亡的发生发展。而众所周知，凋亡在肿瘤的治疗过程中起着至关重要的作用，因此Smac有可能成为肿瘤治疗的新制剂。
因Smac必须在细胞质中才能行使其功能，从而限制了重组人Smac的临床应用，而具有跨膜转导功能的TATPTD，则可弥补这一缺陷。TAT(transactivatingprotein)蛋白是人类免疫缺陷1型病毒(HIV-1)的一个很重要的调控蛋白，具有独特的跨膜转运方式，而这一方式与其分子中一段富含碱性氨基酸的短序列(YGRKKRRQRRR)有关，因此称此段序列为蛋白转导结构域(proteintransductiondomain,PTD)。进一步的研究发现,TATPTD具有广谱的蛋白转导能力，可以引导多种多肽和蛋白质进入目标细胞，迄今为止，已有超过60种蛋白成功运用了此策略，其分子量大小从15-120kDa不等。因此本研究制备了较高纯度的人成熟Smac及Smac-PTD融合蛋白，并对其跨膜转导功能及促细胞凋亡作用进行了初步检测，这为深入研究Smac的促凋亡作用及筛选新型的肿瘤治疗候选分子打下了基础。取得的主要结果如下：
1.经RT-PCR成功地扩增了编码人成熟Smac(56-239)的cDNA(即SmaccDNA)，将PCR产物及原核表达质粒pET28a(+)分别经NcoI+XhoI酶切后构建重组质粒，命名为pET28a-Smac并测序。经查对，与GenBank上登录的编码相应成熟Smac(56-239)cDNA的序列完全一致。
2.以pET28a-Smac为模板经PCR采用上游引物固定，下游引物逐步延伸的方法，将PTD的编码序列(33bp)引入到SmaccDNA的3端，成功扩增了编码Smac-PTD融合蛋白的cDNA，将PCR产物及原核表达质粒pET28a㈩分别经NcoI+XhoI酶切后构建重组质粒，命名为pET28a-Smac-PTD，测序结果与设计序列完全一致。
3.将测序正确的重组质粒pET28a-Smac和pET28a-Smac-PTD转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经NcoI+XhoI双酶切鉴定筛选阳性克隆并扩增培养。经IPTG诱导后，Smac及Smac-PTD均获得了较高水平的表达，并确立它们在大肠杆菌中高效表达的最佳诱导表达条件均为终浓度1mmol/L的IPTG在20℃诱导表达4h。SDS-PAGE分析可见，Smac的大小约为23kDa，Smac-PTD的大小约为24kDa。Westernblotting分析显示，所表达蛋白即为目的蛋白。
4.表达蛋白经Ni2+-NTA层析系统纯化及透析后，行SDS-PAGE,分别可在约Mr23kDa和Mr24kDa处见单一条带，目的蛋白rhSMAC及rhSmac-PTD均获得较好纯化。
5.生物学活性分析显示，所制备的重组人Smac-PTD能够快速有效的进入非何杰金氏淋巴瘤细胞Raji细胞及Hela细胞，并有明显抑制Hela细胞增殖的作用。
Smac的发现为研究肿瘤细胞的凋亡机制及肿瘤的治疗指明了新的方向，而功能性重组人Smac及Smac-PTD的制备则为此创造了必要的条件，同时有助于进一步揭示Smac及PTD的作用机制提供，进而为多种恶性肿瘤的治疗性研究奠定一定基础。