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多数甜瓜(Cucumis melo L.)果实的采后呼吸类型属于跃变型,达到生理成熟的甜瓜果实采收后很快出现呼吸高峰,果肉迅速变软,商品性和贮运性大大降低。据统计,新疆哈密瓜在销售地的短期贮藏损耗达5%~15%,甘肃黄河蜜甜瓜运销过程中的损耗率高达29.3%。实践证明:选育出耐贮运品种能够减少贮运过程中的损耗,是从根本上解决甜瓜贮运难题的有效途径之一。果实的成熟软化与一定数量的果胶被降解有关,这主要是多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase , PG)作用的结果。大量研究证明,甜瓜果实成熟过程中,PG1的mRNA含量最为丰富,能够降解果实细胞壁中的果胶质。应用反义技术通过调控PG基因的表达进而延迟果实的成熟软化在番茄上已取得成功,显示出良好的商业化前景。在甜瓜上,Kristen等已成功克隆甜瓜PG1基因cDNA全序列,这为研究利用反义PG1基因技术调控甜瓜果实的成熟提供了可能。本研究是甜瓜保鲜延熟分子育种研究项目中的一部分。项目的总体研究目标是利用转基因技术获得贮运性状优异的甜瓜新品种。本研究的目标是运用基因克隆技术获得甜瓜的PG1基因全序列,构建其反义序列植物表达载体,将该植物表达载体导入到模式植物烟草中,以检验构建的植物表达载体在植物中的正确表达,为甜瓜的遗传转化奠定基础。通过实验研究获得了如下结果:1.根据Kristen已发表的甜瓜PG1基因1182bp的cDNA全序列设计特异性引物,以从pCMPG/ DH5α中提取的质粒为模板进行PCR扩增,电泳检测扩增产物并回收目的片段后,将其与pGEM-T Easy Vector连接。对经蓝白斑筛选得到的重组质粒进行测序,序列分析结果表明与已知PG1基因核苷酸序列同源性高达99.33%。命名克隆载体为pGEM-PG。2.用SacI和XbaI双酶切pGEM-PG和pBI121两种质粒DNA,分别回收PG1基因片段和除去了gus基因的pBI121线状载体,将pBI121线状载体去磷酸化处理后与PG1基因反向连接,转化大肠杆菌感受态细胞,获得重组质粒。对重组质粒经PCR鉴定、SacI和XbaI双酶切鉴定,均能获得1.2kb的目的片段。用EcoRⅤ酶切重组质粒,电泳图谱出现1205bp的预期条带,证明目的基因片段已反向插入。以上结果表明,成功构建植物表达载体pBI-aPG。3.用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切植物表达载体pBI-aPG,切下3′端加有CaMV35S启动子和5′端加有NOS终止子的PG1反义基因单元35SP-aPG-NOST,随后将其插入到pCAMBIA2301质粒载体上。对重组质粒进行PCR鉴定,可以获得约1200bp的电泳条带,再进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,可切下约3.2kb的预期片段。同时,对挑取的质粒进行XbaⅠ和SacⅠ双酶切,也切下了预期大小为1.2kb的片段。由此可知,成功构建带有gus报告基因的植物表达载体pCA-aPG。4.采用直接转化法分别将插入有反义PG1 cDNA的植物表达载体pBI-aPG和