通过内源RNA引物反转录和测序研究RNA-RNA相互作用

来源 :中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fengjintao1111
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分子内和分子间的RNA-RNA相互作用对于RNA发挥正常的生物学功能有着非常重要的作用,目前已经建立了多种方法来研究RNA-RNA相互作用。大多数方法通过化学修饰、酶切或者交联等手段来形成可以被检测到的反转录终止位点,然后通过计算和分析去除随机的反转录终止位点,最终来确定可能的RNA-RNA相互作用。在本研究中,我们建立了一种基于内源RNA引物反转录(Endogenous RNA-primed Reverse Transcription,ERP-RT)和高通量测序的新方法来直接研究和分析RNA-RNA相互作用。为研究RNA-RNA相互作用,我们意外发现末端不匹配的RNA也可以作为反转录反应的引物。并利用这一发现,我们对小鼠肝脏mRNA用内源RNA引物反转录法进行了反转录反应,构建了相应的cDNA文库并进行了高通量测序。数据分析显示,我们获得了约10%的基因内嵌合序列和约0.4%的基因间嵌合序列。其中基因内嵌合序列主要包括正义-反义,反义-正义,反义-正义-反义三种形式,并且这三种形式都可以被PCR和测序验证。此外,基因内嵌合序列所代表的RNA分子内相互作用可以被关键位点突变和桥式引物反转录所验证。更进一步的研究发现,体外转录的RNA可以通过ERP-RT法获得反义-正义-反义这种复杂的嵌合序列。另外,基因间形成的嵌合序列我们也通过PCR和测序确认了其存在。根据我们推测的ERP-RT法的作用模型,每一条嵌合序列都代表一种独特的分子内或分子间的RNA-RNA相互作用。总之,我们建立了一种全新的基于内源RNA引物反转录和高通量测序的方法从而可以通过嵌合序列高效地鉴定和分析RNA-RNA相互作用,为后续进一步研究RNA-RNA相互作用及相关的生物学功能提供了重要途径。
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