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托品烷生物碱（Tropane alkaloids,TAs）是人类使用的最古老的药物之一,具有抗胆碱活性。其代表性化合物莨菪碱（Hyoscyamine）和东莨菪碱（Scopolamine）作为乙酰胆碱受体拮抗剂,被广泛用来治术前麻醉、治疗神经性疼痛,缓解晕动症和帕金森病等,至今仍是重要的临床基本药物。TAs主要依赖于从茄科天仙子亚族和曼陀罗亚族的少数茄科资源植物中提取。其中,颠茄是我国药典收录的TAs主要商业药源植物,但天然颠茄中TAs的含量很低,无法满足市场需求。面对TAs供不应求的市场现状,利用代谢工程技术提高TAs产量对解决药物供应短缺具有非常重要的意义。近几年,TAs生物合成途径基因陆续被报道,TAs生物合成途径已被完全解析。海螺碱是药用托品烷生物碱的关键前体物质,也是TAs生物合成途径中至关重要的中间产物。催化苯乳酸糖酯化的酶和催化海螺碱生物合成的酶最近才被解析,即苯乳酸UDP-糖基转移酶（Phenyllactate UDP-Glycosyltransferase,UGT1）和海螺碱合成酶（Littorine Synthase,LS）。UGT1催化苯乳酸糖酯化生成苯乳酰葡萄糖;LS催化托品酯化生成海螺碱。然而编码这两个关键酶的新基因（UGT1和LS）在工程化生产TAs中的作用仍然未知。本研究在颠茄毛状根中过表达AbUGT1和AbLS这两个新基因,靶向检测转基因毛状根中TAs含量。探究了两个新基因在TAs代谢工程中的作用,具体的研究结果如下:1.颠茄转基因毛状根的获得与分子检测本研究分别构建了AbUGT1的单基因过表达载体、AbLS的单基因过表达载体,以及AbUGT1和AbLS的双基因共表达载体。并将以上三个植物过表达载体与空质粒p1305.1K分别转入农杆菌C58C1获得工程菌株,采用农杆菌侵染法获得转基因颠茄毛状根。通过基因组PCR鉴定,获得过表达AbUGT1、过表达AbLS和双基因共表达的阳性转基因颠茄毛状根和空质粒对照转基因毛状根;q PCR检测毛状根中目标基因的表达量,检测到各目标基因的表达量均极显著提高。2.过表达AbUGT1提高颠茄毛状根中托品烷生物碱的含量在颠茄毛状根中过表达AbUGT1时,在获得的转基因毛状根中检测到海螺碱和下游药用TAs的含量均显著提高。相较于空质粒对照组毛状根,过表达AbUGT1的毛状根中海螺碱平均含量提高2倍、莨菪碱平均含量提高1.65倍、山莨菪碱平均含量提高1.83倍、东莨菪碱平均含量提高2.45倍。这些物质的含量检测结果表明,苯乳酸的糖酯化反应可能是潜在的限速步骤,过表达AbUGT1显著促进海螺碱及下游药用TAs的积累。3.过表达AbLS提高颠茄毛状根中托品烷生物碱的含量在颠茄毛状根中过表达AbLS时,在获得的转基因毛状根中海螺碱和下游药用TAs的含量均显著提高。相较于空质粒对照组毛状根,过表达AbLS的毛状根中海螺碱平均含量提高1.67倍、莨菪碱的平均含量提高2.16倍、山莨菪碱的平均含量提高2.29倍、东莨菪碱的平均含量提高2.45倍。以上途径中代谢物的含量检测结果表明,过表达AbLS可以打破海螺碱合成的限速步骤,从而显著促进海螺碱及下游药用TAs的积累。4.共表达AbUGT1和AbLS更大程度提高颠茄毛状根中托品烷生物碱含量在颠茄毛状根中共表达AbUGT1和AbLS时,检测到转基因毛状根中海螺碱和下游药用TAs的含量均大幅度提高,还检测到转基因毛状根中托品酮和托品的含量发生不同程度降低。相较于对照组毛状根,双基因共表达毛状根中海螺碱的平均含量提高4.07倍、莨菪碱的平均含量提高3.20倍、山莨菪碱的平均含量提高2.91倍、东莨菪碱的平均含量提高2.36倍;同时,托品酮的平均含量降低为对照组毛状根含量的58.82%、托品的平均含量降低为对照组含量的83.16%。双基因共表达AbUGT1和AbLS时,海螺碱、莨菪碱和山莨菪碱的含量提高幅度远高于单独过表达AbUGT1或单独过表达AbLS。其中,相较于单基因过表达AbUGT1的毛状根,双基因共表达毛状根中海螺碱平均含量提高2.03倍、莨菪碱平均含量提高1.95倍、山莨菪碱平均含量提高1.59倍。相较于单基因过表达AbLS的毛状根,双基因共表达毛状根中海螺碱平均含量提高2.44倍、莨菪碱平均含量提高1.48倍、山莨菪碱平均含量提高1.27倍。以上含量检测结果表明,共表达AbUGT1和AbLS可以更加强力的推动TAs代谢流,促进海螺碱和下游药用TAs的积累。综上所述,本研究在颠茄毛状根中采取单基因过表达和双基因共表达两种形式,探究了TAs生物合成中的中间限速步骤——苯乳酸的糖酯化和海螺碱的生物合成,发现催化该限速步骤的两个酶AbUGT1和AbLS在TAs代谢工程中的作用,并发现推动海螺碱的合成是药用TAs代谢工程的有效策略。