目的:脑缺血疾病的治疗具有严格的时间窗限制。准确识别缺血性事件发生后,疾病在不同时相的发展机制对于把握疾病特点、确定治疗思路、延长治疗时间窗等至关重要。因此,本研究旨在明确丹红注射液抗脑缺血进程中相关蛋白机制的发展与变化,旨在揭示和量化脑缺血模型下TLR4/NF-κB/HIF-1α通路及相关蛋白的变化与丹红注射液作用的关联,为丹红注射液的临床应用及其在脑缺血疾病中深入的作用提供更明确的机制依据。研究内容:研究一:丹红注射液抗脑缺血的药效作用研究,旨在探究丹红注射液抗脑缺血的最佳剂量,采用不同浓度的药物干预,以神经功能评分及脑梗死率作为评价指标,确定最佳给药剂量。研究二:丹红注射液抗脑缺血进程的蛋白表达研究,旨在探究丹红注射液治疗脑缺血的蛋白表达情况,由单一时间点扩展成多时间点,以获取药物对于脑缺血时间进程的干预情况。研究三:蛋白网络规律研究,旨在挖掘脑缺血进程下的蛋白表达变化规律,采用动态贝叶斯网络模型进行构建和拟合,以揭示脑缺模型及药物干预下的时间机制变化。方法:1.药效学方法:SPF级雄性SD大鼠,将大鼠随机分为假手术组,模型组,丹红注射液高、中、低剂量组（0.72 mL.kg-1;0.36 mL·kg-1;0.18 mL·kg-1）,阳性药组（金纳多注射液）。对大鼠进行MCAO手术以制备脑缺血模型,假手术组不插入线栓,其余步骤一致。缺血造模完成15 min后各组尾静脉注射给药,造模24 h后对实验大鼠的神经功能评价,神经功能评价后,将大鼠断头取脑,采用TTC染色,根据染色面积计算脑梗死率。通过比较神经功能评分及脑梗死率确定最佳给药剂量。2.蛋白表达研究:分为三节内容。第一节:将大鼠随机分为假手术组、模型组、丹红组,对大鼠进行MCAO手术以制备脑缺血模型,丹红组尾静脉注射最佳给药剂量。脑缺血24 h后,采用神经功能评价及线栓位置评估造模情况。评价完成后,在冰上迅速分离出大鼠患侧皮层部分,将皮层组织破碎、离心等,获得组织提取液,采用BCA法测定皮层的蛋白浓度。以β-actin作为内参蛋白,采用Western Blot法测定脑缺血24 h下TLR4、MyD88、TAK1、IKK、NF-κB、mTORC1、HIF-1α的蛋白表达。分析组间差异蛋白。第二节:除在脑缺血6 h或12 h下进行神经功能评价并取材,以及采用Western Blot法测定脑缺血 6h、12h下TLR4、MyD88、TAK1、IKK、NF-κB、mTORC1、HIF-1α的蛋白表达外,其余方法与第一节一致。第三节:比较同种蛋白在相邻时间下的差异表达,分析同种蛋白在不同时相（6 h、12 h、24 h）的变化及变化趋势。3.蛋白规律研究:采用动态贝叶斯网络建模,进行数据拟合,获得相应蛋白在缺血状态下以及缺血合并丹红注射液治疗状态下的拟合方程。结果:1.药效学结果神经功能评价结果:与模型组相比,丹红注射液高、中剂量（0.72 mL·kg-1;0.36 ml·kg-1）组的神经功能评分显著降低（P＜0.05;P＜0.05）,丹红注射液低剂量（0.18 mL·kg-1）组呈降低趋势,无显著性差异。脑梗死率结果:与模型组相比,丹红注射液高、中剂量（0.72 mL·kg-1;0.36 mL·kg-1）组的脑梗死率显著降低（P＜0.001;P＜0.01）,丹红注射液低剂量（0.18 mL·kg-1）组呈降低趋势,无显著性差异。不同剂量间存在量效关系表现,高剂量缩小脑梗死体积作用更佳,是本实验筛选出的最佳剂量,并用于后续实验。2.蛋白表达结果脑缺血24h下,蛋白具有3种表达趋势。（1）模型组高表达且给药组回调:TLR4、IKK、NF-κB、HIF-1α蛋白表达趋势相近,与假手术组相比,模型组蛋白表达显著升高（P＜0.001;P＜0.001;P＜0.001;P＜0.001）;与模型组相比,丹红组蛋白表达显著降低（P＜0.001;P＜0.01;P＜0.01;P＜0.05）。（2）模型组低表达且给药组回调:MyD88、mTORC1蛋白表达趋势相近,与假手术组相比,模型组蛋白表达显著降低（P＜0.01;P＜0.001）;与模型组相比,丹红组蛋白表达显著升高（P＜0.001;P＜0.001）。（3）模型组高表达但给药组未回调:与假手术组相比,模型组TAK1蛋白表达升高,无显著性差异;与模型组相比,丹红组蛋白表达显著升高（P＜0.05）。脑缺血6 h或12h下,蛋白具有3种表达趋势。（1）脑缺血6h、12 h后给药组均出现回调趋势:与假手术组相比,模型组TLR4在6 h和12 h显著升高（P＜0.01;P＜0.01）;与模型组相比,丹红组TLR4具有抑制趋势,无显著性差异。与假手术组相比,模型组mTORC1在6 h和12 h显著降低（P＜0.001;P＜0.05）;与模型组相比,丹红组mTORC1表达显著升高（P＜0.001;P＜0.05）。（2）仅脑缺血6h后给药组出现回调趋势:与假手术组相比,模型组TAK1在6h和12h显著升高（P＜0.001;P＜0.01）;与模型组相比,6h丹红组TAK1具有降低趋势,无显著性差异,12h丹红组TAK1蛋白表达显著升高（P＜0.001）。（3）仅脑缺血12 h后给药组出现回调趋势:6 h模型组和丹红组MyD88均具有升高趋势,均无显著性差异。与假手术组相比,模型组MyD88在12 h显著降低（P＜0.001）;与模型组相比,丹红组MyD88蛋白在12h显著升高（P＜0.01）。缺血6h和12h,IKK、NF-κB和HIF-1α蛋白表达趋势相近,与假手术组相比,3种模型组蛋白在6h显著升高（P＜0.05;P＜0.01;P＜0.01）;与模型组相比,3种丹红组蛋白6 h具有升高趋势,无显著性差异;与假手术组相比,3种模型组蛋白在12 h显著升高（P＜0.001;P＜0.001;P＜0.05）;与模型组相比,丹红组IKK、NF-κB蛋白在12 h显著降低（P＜0.01;P＜0.01）,丹红组HIF-1α蛋白在12 h具有降低趋势,无显著性差异。不同时相结果:TLR4、TAK1、HIF-1α模型组各时间点表达均高于假手术组,模型组及丹红组蛋白表达趋势为“升高—降低—升高”。IKK、NF-κB模型组各时间点表达均高于假手术组,丹红组6 h高于模型组,12 h、24 h低于模型组。IKK、NF-κB模型组蛋白表达趋势为“升高”,丹红组蛋白表达趋势为“升高—降低—升高”。MyD88模型组6 h高于假手术组,12 h、24 h低于假手术组,丹红组各时间点均高于模型组。模型组及丹红组的MyD88蛋白表达趋势为“升高—降低—维持”。mTORC1模型组各时间点表达均低于假手术组,丹红组各时间点均高于模型组。模型组及丹红组mTORC1蛋白表达趋势为“降低—维持”。3.动态贝叶斯网络拟合结果:所测模型组及给药组蛋白表达均拟合成方程及曲线的形式。结论:1.丹红注射液显著改善脑缺血大鼠的神经功能评分,缩小脑梗死体积,最佳给药剂量为0.72 mL.kg-1。脑缺血模型早期（6 h）运动功能损伤相对较低,中、后期（12h、24 h）损伤更为严重,丹红注射液对于运动功能恢复的程度无时间差异,都是恢复至1分水平,即左侧前爪不能完全伸展的表现。2.TLR4、IKK、NF-κB、HIF-1α蛋白变化趋势相近,均随缺血激活而不断升高,反映出脑缺血后炎症相关通路的激活、发展与变化趋势,是随时间推移而不断扩展的。丹红注射液对这些蛋白的影响趋势类似,早期（6h）迅速升高,最终实现对于这些蛋白的抑制,标志着丹红注射液对于缺血下炎症相关通路的改善。3.TAK1与MyD88蛋白变化趋势相近,均在早期（6h）随缺血而升高,中、后期（12 h、24 h）表现出受到损伤或抑制的持续低水平,反映出脑缺血后的蛋白受损情况。这两种蛋白均存在有益及损害的双重作用表现。丹红注射液抑制早期（6h）过高表达的TAK1,促进中、后期（12h、24h）过低表达的TAK1,发挥保持平衡与稳态的保护作用。此外,丹红注射液延缓MyD88的水平降低,也是保护作用的体现。4.mTORC1蛋白的变化趋势在蛋白网络中特殊,在缺血早期（6 h）即受到抑制,并长期处于低水平,反映出大脑多种功能受损的情况,更接近缺血后的损伤状态。丹红注射液促进mTORC1的表达而发挥保护作用,使其表达水平维持在正常和缺血之间的状态。