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猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的病原体,属于尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属成员,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。PED是急性、高度接触性肠道传染病,典型症状为呕吐、腹泻和脱水等。新出现的PEDV毒株具有高致病性,在仔猪中死亡率高达80～100%。该病于1971年在英国首次被发现,随后迅速扩散至周边国家,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前,对PED的防控除了综合性生物安全措施外,主要依靠疫苗进行防控。由于病毒不断变异,疫苗的保护效力逐渐降低。因此,寻找一种新的抗PEDV药物对养猪业的发展具有一定的潜在价值。来氟米特(Leflunomide)是一个新型免疫抑制剂,可用于治疗类风湿性关节炎(RA)以及自身免疫性疾病。来氟米特及其活性代谢产物A77 1726作为一种多靶点的免疫抑制剂,能够抑制多种酶的活性,包括p70 S6激酶(S6K1)、二氢乳清酸脱氢酶(DHO-DHase)以及JAK和Src家族蛋白酪氨酸激酶(PTK)。近年来研究发现,来氟米特及其活性代谢产物A77 1726具有广泛的抗病毒作用,但其抗病毒的机理仍存在很大争议。来氟米特是一种小分子、易于合成的化合物。本论文探究A77 1726能否抑制PEDV复制以及其可能存在的分子机制。首先,我们用中等毒力的HLJBY毒株感染猪肠上皮细胞系IPEC-DQ细胞,用分离的HXLV和CAJ毒株感染非洲绿猴肾细胞系Vero细胞,在不同浓度的A77 1726作用下,Western blot结果显示,A77 1726呈剂量依赖性降低PEDV病毒蛋白S和N的表达水平。在上述试验的基础上,再加入高浓度的尿苷(Uridine)使得细胞内嘧啶单核苷酸水平恢复正常,A77 1726仍能够呈剂量依赖性抑制PEDV病毒蛋白S和N的表达水平。收集上述试验的细胞培养上清测定病毒TCID50,结果显示A77 1726呈剂量依赖性降低培养上清中的病毒滴度。上述结果表明A77 1726能够抑制PEDV复制,其抑制作用与抑制嘧啶单核苷酸的合成无关。为进一步探究A77 1726抑制PEDV复制的机制,我们分别用S6K1抑制剂PF-4708671、DHO-DHase 抑制剂 Brequinarsodium(BQR)、蛋白酪氨酸激酶 JAK 抑制剂Ruxolitinib(Rux)和 Src 抑制剂 SU6656 处理感染 PEDV 的 Vero 细胞。Westernblot 结果显示,PF-4708671和BQR对PEDV病毒蛋白S和N的表达水平没有影响,而Rux和SU6656均能够剂量依赖性降低PEDV病毒蛋白S和N的表达水平。病毒TCID50结果显示,Rux和SU6656均显著降低培养上清中的病毒滴度。这些结果间接说明A771726通过抑制JAK和Src激酶活性来抑制PEDV复制。本实验室早期通过体外激酶试验发现,A77 1726可抑制JAK1和JAK3以及Src家族酪氨酸激酶活性。在此,我们将探究A77 1726是否能抑制不感染或感染PEDV的细胞中酪氨酸激酶活性。通过Western blot分析酪氨酸激酶及其底物的磷酸化水平,结果显示,A771726能够抑制Vero细胞中JAK1、JAK2、STAT3和Src的磷酸化以及降低总蛋白酪氨酸磷酸化的水平。在感染PEDV的细胞中,A77 1726有效抑制了 JAK1的磷酸化,但对JAK2和STAT3的磷酸化抑制效果不明显。进一步研究发现,PEDV感染本身能抑制STAT3的磷酸化,这很好的解释了 A77 1726对未感染和感染PEDV细胞中的相关蛋白磷酸化抑制的差异性。为进一步验证A77 1726通过抑制JAK和Src激酶活性抑制病毒复制,外源性表达Src和JAK2及其下游STAT3基因,Western blot结果显示,Src、JAK2和STAT3基因过表达显著增强PEDV病毒蛋白S和N的表达水平,相应基因的蛋白磷酸化表达水平显著增加。病毒TCID50结果显示,A77 1726抑制病毒蛋白合成的能力明显低于转染空载体对照组。这些结果表明A77 1726通过抑制PTK活性来抑制PEDV复制。综上所述,我们的研究结果显示A77 1726能有效抑制PEDV复制。分子机制研究发现A77 1726通过抑制JAK和Src家族的酪氨酸激酶活性来抑制PEDV复制。