应激是机体在受到各种强烈因素(即应激原)剌激时,体内出现以交感神经兴奋和垂体-肾上腺皮质分泌增多为主的一系列神经内分泌反应,它对生物的存活具有十分重要的意义。适宜的应激反应有助于提高个体对环境的适应能力;过度的尤其是慢性应激会导致不同程度的生理、心理障碍,甚至引起躯体疾病。由于慢性应激是许多疾病发生和发展的重要因素,又与亚健康状态直接相关,上个世纪80年代以来,国内外学者对其进行了大量的研究。应激涉及了人体的多个系统,在不同应激原、不同个体、不同的环境下,可能导致的结果也不同,这给预防和治疗应激性疾病造成了困难,而中医药的整体调整、辨证论治、个体化诊疗等理念在这方面已显示出了更大的优越性。本课题为国家自然科学基金资助课题(310000216),从应激反应的行为学、外周与中枢机制和肝主疏泄功能调节两个方面及其相互关系进行了理论探讨和实验研究。一、理论探讨从人的本能需求来诠释肝主疏泄理论。本能需求是肝主疏泄功能产生的核心。动机是本能需求的外显表现,情绪是本能需求内在驱动的产物,认知则是对本能需求的评价,奖赏是需求得到满足时产生的满足感。慢性束缚应激模拟了肝失疏泄的病理过程,而逍遥散的治疗促进了肝主疏泄功能恢复。本课题从行为学着手,研究了慢性束缚应激大鼠与本能需求相关的动机行为(摄食行为,饮水行为),情绪相关行为(旷场实验和高架十字迷宫),认知行为(Y迷宫)和奖赏相关行为(糖水消耗实验),从而更好的阐明了慢性束缚应激导致的行为学改变及逍遥散的调节作用,进一步探讨肝主疏泄的内涵。应激反应是为躲避危险和不利环境所造成的神经生物学的改变,过度的尤其是慢性应激会导致机体不同程度的损伤,而应激复原(stress resilience)机制是恢复稳态,通过改变达成稳态。慢性束缚应激损伤是肝失疏泄或疏泄太过的体现,而逍遥散的调节作用则有利于应激复原机制,也是肝主疏泄功能的体现。应激损伤与应激复原系统是相互联系的,而调节应激损伤及复原的因素和大脑区域以及相关神经环路也是相互联系的。所以提出假设,以上应激损伤及复原因素和应激损伤及复原大脑区域及相关神经环路是否就是肝主疏泄的神经生物学基础。由于边缘系统,特别是海马、下丘脑、杏仁体,不但是动机,情绪和认知形成和调节的中心,而且还调控着人体的本能性活动,维持内环境的自稳态,因此,边缘系统为肝主疏泄的调控中枢。由于本能需求是肝主疏泄功能产生的核心,奖赏则是肝主疏泄内涵的体现,所以中枢奖赏系统的神经环路可能是肝主疏泄的神经通路之一。在奖赏的主要神经环路中,伏核是边缘和基底神经节的中继结构。伏核接受来自海马结构、杏仁核、中线核群、中脑腹侧被盖区和中央前额叶皮层的传人信号,并且伏核自己投射到腹侧乳头体、脚桥核、下丘脑、黑质和中脑腹侧被盖区。最终,在中央和两侧额皮质、海马、伏核、杏仁核和杏仁核延伸部位有了广泛的相互联系。NPY与CCK均与应激导致的摄食异常、焦虑样行为、抑郁相关行为及学习记忆认知行为有关,而这些行为的改变又与边缘系统和中枢奖赏系统(兴致缺失)有着密切的联系。NPY在应激反应中的效应包括:抗焦虑;对抗应激造成的CRH效应和蓝斑-去甲肾上腺素系统;损伤恐惧记忆。而CRH效应则是:激活恐惧行为,增强唤醒,增强自主活动,抑制植物神经系统的功能,降低奖赏期待。蓝斑-去甲肾上腺素系统效应则是:被外界和内在的威胁所激活的报警功能,增加唤醒,增加注意力,恐惧记忆形成,促进自主反应。NPY在应激反应中涉及的脑区有杏仁核,海马,下丘脑,中隔,水管周围灰质,蓝斑。NPY在应激反应中涉及的主要相互功能包括:减少了杏仁核CRH-相关效应,减低蓝斑发放率。NPY与复原相关机制:杏仁核NPY适当的上调与减少应激导致的焦虑抑郁有关.NPY与应激导致的精神病理学机制:在应激中,低水平的NPY反应与抑郁和PTSD的易损性的增加有关。CCK与多巴胺调制的奖赏系统有着密切的联系,乙酰胆碱、阿片样物质及CCK调制谷氨酸和多巴胺的释放,CCK对奖赏具有抑制效应。因此NPY与CCK均与奖赏系统相关。NPY和CCK均是多功能性神经肽,据大量的文献分析,NPY是增食欲剂,而CCK是减食欲剂;在应激反应中,NPY是应激复原(stress resilience)因子,而CCK与应激损伤相关。NPY与CCK是否体现了中医整体阴-阳平衡。NPY-CCK的平衡调制,则肝主疏泄功能正常,NPY与CCK的不平衡调制则体现了肝失疏泄或疏泄太过。提出假设NPY和CCK系统在中枢奖赏系统中的不平衡调制(应激损伤和应激复原的对抗)可能是引起慢性束缚应激大鼠行为学改变的机制之一,同时也论证了脑肠轴神经肽NPY、CCK系统可能是肝主疏泄的病理生理学基础之一。NPY与CCK系统在大脑奖赏系统中又是如何调节肝主疏泄的功能呢?当NPY-CCK在中枢奖赏系统的调制失衡,如引起奖赏系统的过度激活,导致了肝疏泄太过的体现,抑制了奖赏系统则肝失疏泄,平衡则肝的疏泄功能正常。二、实验研究实验研究包括了逍遥散对慢性束缚应激大鼠行为学影响,慢性束缚应激大鼠血浆NPY、CCK浓度变化及逍遥散对其影响的ELISA分析,以及运用免疫组织化学方法,以边缘系统与中枢奖赏神经环路中六个有密切联系的部位,杏仁核、海马、额皮质、下丘脑、伏核和尾状壳核作为观察对象,以疏肝解郁名方逍遥散作为干预措施,从蛋白水平,半定量和定位检测了逍遥散对束缚应激状态下中枢脑肠肽NPY、CCK变化的调节作用,探讨应激反应和应激损害及应激复原的中枢机制及其与中医肝主疏泄功能间的关系。主要结果如下:行为学结果提示:慢性束缚应激对大鼠体重增长以及摄食量和饮水量均有一定程度的损害,而中药逍遥散对其有一定的保护作用。模型组糖水消耗量最高,治疗组其次,最少的是正常组。但从折线图的趋势来看,在第21天以后,正常组的糖水消耗量开始上升,模型组的糖水消耗量开始下降,说明在慢性束缚三周后,动物由兴奋、焦虑开始转向抑郁状态。旷场行为测试法观测大鼠在新异环境中的自发活动和探究行为的改变,模型组动物均有所下降,中药复方逍遥散有缓解慢性束缚应激造成大鼠身心疲惫的作用。高架十字迷宫反映了模型组动物的焦虑状态,以及逍遥散有一定的抗焦虑作用。Y-迷宫反映了动物逃避条件反射能力和空间分辨反应的学习记忆能力。在本实验中Y-迷宫寻找安全区正确率三组之间有差异,但无统计学意义,其中模型组与正常组比较有显著性差异,P=0.026。Y-迷宫寻找安全区正确率为模型组最高,治疗组其次,正常组最低。免疫组织化学结果提示:21天慢性束缚应激使NPY与CCK表达在海马区和ARC区均下降,而治疗组表达增多,提示了逍遥散对应激复原具有一定的促进作用。在BLA区,PEV区,伏核区及FCx区模型组NPY的表达下调而CCK的表达上调,提示NPY与CCK在应激反应中具有不同的作用。NPY能促进应激复原,CCK有应激损伤效应。血浆ELISA分析提示:与正常组比较,模型组NPY和CCK在外周血浆中的浓度显著性降低,治疗组的NPY、CCK血浆浓度与模型组相比有所升高,说明了逍遥散方剂有促进应激复原的作用。