下肢动脉硬化闭塞症（Atherosclerosis obliterans,ASO）是最常见的伴有较高并发症和死亡率的下肢慢性缺血性疾病，目前临床大多采取自体静脉或人造血管移植予以治疗。然而不管采取何种血管移植术，血管重建部位6个月内再狭窄率（Restenosis， Rs）达30%-50%。Rs形成后，由于下肢动脉粥样硬化的发展，几乎均无例外最终导致下肢的坏疽。在临床上，我们每个月都要为数例下肢坏疽的病人行截肢或截趾术，令人非常惋惜及内疚，这迫使我们去寻找全新的更有效的防止方法和拯救措施。据此，本课题将主要解决以下两个问题：（1）临床仍缺乏有效防止再狭窄的药物，随着增生内膜中细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）的大量堆积在Rs发生中核心环节的证实，发现一种新的基因和药物抑制ECM堆积已成为亟待解决的课题；（2）对于已经有狭窄发生而失去手术时机的患者是否有促进其侧支循环建立即治疗性血管生成的方法。分题一 金属蛋白酶抑制剂在血管移植后再狭窄防止中的作用目的： 转染TIMP-2基因，观察其对损伤兔血管平滑肌细胞（ VSMCs）增殖、金属蛋白酶（MMP）活性、ECM合成及PKC信号转导分子表达的影响。在大鼠静脉移植后内膜增生（IH）的动物模型中，观察强力霉素（MMP抑制剂）对MMP和IH的抑制作用。以期探讨TIMP-2抑制损伤VSMC增殖迁移、ECM合成的可能机制，证实强力霉素在动物实验中防止静脉移植后IH的可能，为临床应用TIMP-2及类似抑制物强力霉素防止Rs提供理论基础。方法： 损伤激活原代培养VSMC，Lipofectine介导TIMP-2基因转染损伤VSMC；Western blot鉴定。采用直接计数法和BrdU掺入法测定转染后VSMC增殖情况；应用酶图法和免疫细胞化学方法分别测定转染后VSMC MM2/9活性和Ⅳ型前胶原蛋白表达的变化。应用半定量RT-PCR和Western blot分别观测TIMP-2转染对损伤VSMC内信号转导分子PKCα、ERK mRNA和蛋白表达水平的影响；用凝胶电泳迁移率变动分析 （EMSA）观察TIMP-2转染对损伤VSMC 核因子NF-κB活性的影响。建立大鼠静脉移植后内膜增生（IH）的动物模型；以肝素作对照，用酶图法检测强力霉素对移植血管MMP活性的影响，并用HE和VG染色观测强力霉素对内膜面积和I/M的影响。结果： 体外细胞部分结果显示：兔VSMC损伤后，细胞增殖加快2.8倍，金属蛋白酶MMP2/MMP9活性分别提高2倍、3倍，Ⅳ型前胶原蛋白表达合成增加1.6倍。TIMP-2基因转染后细胞增殖被抑制1.3倍和1.6倍；金属蛋白酶<WP=7>MMP2/MMP9活性被抑制3倍和2倍；Ⅳ型前胶原蛋白表达被抑制3倍。信号转导研究的结果显示：体外损伤的VSMC ERK1/2显著增加。PKCα、 NF-κB在正常VSMC中很少表达，但在损伤的VSMC中这种表达非常显著，对兔VSMC进行TIMP-2转染后,损伤的VSMC ERK1/2蛋白表达受抑制，并且PKCα 、NF-κB的表达下调。体内动物部分结果显示：大鼠自体静脉移植后1周，MMP9表达活性，到第4周到高峰，持续到8周，强力霉素能抑制 MMP9的活性表达，在第4周抑制1.76倍，第8周抑制2倍。图象分析结果显示：大鼠自体静脉移植后，肝素和强力霉素都有减少I/M和内膜面积的作用，第4周明显，在第8周最强，比较肝素，强力霉素的减少作用更加显著。I/M方面，在第4周肝素组I/M值是强力霉素组的1.87倍,第8周是1.64倍；内膜面积方面，在第4周肝素组内膜面积是强力霉素组的2倍，第8周是1.75倍。结论： TIMP-2基因能通过抑制细胞增殖、金属蛋白酶MMP2/MMP9活性和Ⅳ型前胶原蛋白表达来改变损伤VSMC的生物学行为。PKCα 、NF-κB在损伤的VSMC增殖迁移、ECM合成中有重要作用，TIMP-2可通过抑制PKCα 、NF-κB来影响VSMC迁移, ECM的合成，从而表现出相应的非增殖抑制效应（抗迁移、抗ECM、抗损伤）。强力霉素能通过抑制MMP9活性，降低I/M比值，减少ECM的堆积，防止再狭窄的发生。关键词： 平滑肌细胞 内膜增生 再狭窄 金属蛋白酶抑制剂2 基因转染蛋白激酶C 核因子NF-κB 静脉移植 强力霉素<WP=8>分题二 电刺激对血管狭窄后下肢缺血的血管生成作用目的： 研制用于下肢缺血的电刺激装置，观察其对后肢缺血大鼠血管新生的作用，并探讨这种作用的分子机制及对再狭窄的潜在影响，以证实电刺激对下肢缺血的治疗性血管生成作用，为已经有再狭窄发生而失去手术时机的患者提供一个促进侧支循环建立、改善下肢缺血的方法。方法： 股动脉结扎法建立血管狭窄后的缺血模型，自行研制的电刺激装置用于治疗后肢缺血的大鼠，激光多普勒测定其血流，Ⅷ因子免疫组化检测缺血骨骼肌中内皮细胞数和毛细血管密度，RT-PCR和免疫组化分别检测VEGFmRNA和蛋白的表达，Western blot和免疫荧光测定FLK-1和FLT-1两受体的表达，用酶图法、RT-PCR及EMSA 分别检测 MMP、PKCα及NF-κB的表达。结果： 25Hz、0.1V电刺激不会引起肌肉收缩，连续刺激大鼠骨骼肌7天后，缺血后肢血流增加80%，而非电刺激组变化不明显，缺血骨骼肌中内皮细胞数比较非刺激组增加2.67倍，毛细血管密度增加的2.18倍，VEGFmRNA增加3倍、蛋白增加2倍，VEGF受体FLK-1的表达增加，而FLT-1的表达在刺激组和非刺激组无变化。同时发现