婴幼儿配方奶粉(PIF)作为除母乳之外,婴幼儿这一特殊人群的主要膳食营养来源,确保其产品质量与消费安全意义非凡。PIF产品中的微生物量超标甚至出现致病菌的现象,是导致其质量安全问题的重要原因之一,因此对PIF中的微生物污染的有效控制至关重要。为控制PIF中的微生物污染,本文开发了两种PIF中克罗诺杆菌的快速检测法,以期实现PIF中致病菌的快速检测与监控。首先以克罗诺杆菌属的cgcA基因序列设计引物,建立了具有种间特异性的HRM-real time PCR方法,用于PIF中的致病性克罗诺杆菌的快速分型与检测。该法能有效的区分6种致病性克罗诺杆菌,得到的Tm值为86.02℃～86.80℃,灵敏度为0.1 pg～1 pg。即使受污染的样品经过了长达4周的干燥处理,本法仍能在经过12 h增菌培养后检出污染量为2 CFU/25g的克罗诺杆菌。其次以阪崎克罗诺杆菌的cgcA基因序列设计出特异性探针和引物,建立了 TaqManqRT-PCR法,在复溶的PIF中对阪崎克罗诺杆菌的检出限为1100 CFU/g,且经过6 h的增菌培养后,检出限为2CFU/25g。上述方法均大大缩短了 PIF中克罗诺杆菌检测所需的时间,且具有操作十分简便的优点。污染了 PIF的致病菌在加工贮藏以及消费过程中,能够通过各种逆境应答机制耐受多种环境胁迫,环境压力也能促使致病菌分泌各种毒力因子给食品安全带来极大的威胁。为探讨PIF中致病菌的逆境应答机制,本文运用组学方法,系统地研究了阪崎克罗诺杆菌在PIF中对干燥环境的应答机制;以及沙门氏菌和EHEC 0157:H7在模拟胃消化液酸条件下引起ATR应答机制;在ATR应答机制的研究的基础上,进一步探讨了沙门氏菌中一种广泛存在的逆境应答。具体为针对逆境应答关键调控功能群即铁硫簇蛋白,研究了 NfuA蛋白在铁硫簇蛋白组装与成熟中的作用。1)通过对干燥处理前后阪崎克罗诺杆菌的蛋白组分析发现,在干燥逆境胁迫下,共鉴定得到233个丰度差异显著蛋白,其中146个蛋白出现下调,87个蛋白出现上调。在整体调控机制上,为应对长期干燥环境,阪崎克罗诺杆菌主要靠减少非必须或耗能大的功能的表达,如抑制毒力、黏附、侵袭以及鞭毛组装等来减少细胞能量和物质的消耗;另外,通过增加海藻糖和甜菜碱的合成以及激活ABC转运蛋白与相关分泌蛋白,使得海藻糖和甜菜碱等渗透压保护剂在细胞内积累来保持胞内水分。2)通过转录组分析ATR应答发现,不同致病菌具有不同的质子平衡机制。在普通大肠杆菌中,共鉴定得到110个差异表达基因,细胞通过调节cadAB控制赖氨酸脱羧系统消耗多余的质子;在EHECO157:H7中,共鉴定得到223个差异表达基因,主要通过调节由ahpC控制的氧化还原反应和mhpA控制的氢化反应消耗多余的质子;在肠炎沙门氏菌中,共鉴定得到554个差异表达基因,细胞通过促进乙酰辅酶A的消耗来降低蛋白质乙酰化水平,升高细胞内NAD(+)/NADH比例,防止细胞内pH值在酸逆境中进一步下降。除了存在不同的质子平衡机制外,EHECO157:H7的耐酸性高于普通大肠杆菌的原因可能是,通过提高细胞中铁硫簇稳定、过氧物酶体和ROS清除剂等的活性,提高细胞应对不利环境的能力。沙门氏菌在面对酸性环境时,细胞遭受了氧化损伤和游离铁不足的情况,进而严重影响细胞内铁的稳态及铁硫蛋白的功能。在肠炎沙门氏菌中,许多与铁硫簇的生物功能相关的基因的表达量,在ATR应答中出现了明显上调。3)本文中以丙三羧酸代谢与维生素B1代谢为模型,研究NfuA蛋白在铁硫簇蛋白组装中的作用。结果表明,NfuA虽然不属于Isc系统和Suf系统,却与两个系统的正常功能活性均相关。NfuA与ApbC在沙门氏菌中铁硫簇蛋白的组装和成熟过程中具有一定的功能冗余;在丙三羧酸代谢过程中,与ApbC作用位点一致,共同参与了铁硫簇蛋白TcuB的组装与成熟;在维生素B1代谢过程中,通过影响铁硫簇蛋白ThiC与ThiH的组装与成熟,影响HMP与THZ的合成,进而影响细胞自身合成维生素B1。这说明铁硫簇蛋白的组装出现缺陷时,将通过影响铁硫蛋白的功能而影响细胞功能。通过营养素的补充或者剥夺以控制特定的代谢,有望成为有效的控制微生物污染的手段。通过上述研究,为保证PIF的食品安全,从技术方面为对污染进行有效监控给提供了快速检测法这一解决方案,同时从理论方面填补了在PIF加工贮藏和消费过程中致病菌的逆境应答机制的空白,为通过控制逆境应答过程进而控制PIF中致病菌的污染提供了科学支持。