喀斯特是地表水和地下水对可溶性岩石进行溶蚀等作用所形成的地表和地下的地貌形态的总称。在喀斯特地貌发育地区,地面往往奇峰林立,地表水系比较缺乏,但地下水系却比较发达。喀斯特地貌的特殊性又在于它不仅有地表的,而且有与其成因联系的地下喀斯特形态——洞穴。溶有碳酸氢钙的水,当从溶洞顶滴到洞底时,由于水分蒸发或压强减少,以及温度的变化都会使二氧化碳溶解度减小而析出碳酸钙的沉淀。这些沉淀经过千百万年的积聚,渐渐形成了钟乳石、石笋等洞穴沉积物。洞穴石笋是大气圈、水圈、生物圈和岩石圈等多圈层相互作用的产物。气候对其生长及组成的影响深刻,这使得石笋成为陆地古环境、古气候研究不可多得的理想材料。近年来,人们利用洞穴沉积物的沉积特征、物质成分和同位素组成等地球化学指标在重建过去气候和环境变化上取得了重要进展,而洞穴石笋则因为时间跨度大、敏感程度高、蕴含丰富的古气候信息,在第四纪的研究中具有重要意义。分子化石的研究发现保存在石笋中痕量的来自生物体的类脂物指标可以灵敏反映气候变化,而其中部分类脂物则来自于微生物,并且其他类脂物也呈现出微生物改造的迹象,因此开展洞穴中微生物的研究将对揭示洞穴石笋中有机物的来源、微生物在石笋形成中的作用以及微生物对其他有机物的改造等具有重要价值,并且还将为古气候变化的微生物指标提供数据。对洞穴微生物的研究,前期主要是通过纯培养的方法获取样品中微生物的信息:然而,据估计仅有0.1%-1%的微生物能用目前的培养技术培养起来,因此利用传统的微生物培养方法只能获取十分有限的微生物信息。随着分子生物学的迅猛发展,大部分不可培养的微生物的信息便可通过DNA体外扩增的方法得到其遗传信息,再通过克隆测序的方法就可获得样品中尽可能多的微生物信息。目前此领域的研究工作,大多研究的是微生物在一个或几个洞内的分布及其在矿物岩石形成中的作用,对于洞内微生物种群在时间序列上的变化还缺乏系统的研究,尤其是缺乏将微生物的研究与全球气候变化相结合的研究,本文的研究正好揭示该领域研究中的一些盲点。本实验以湖北清江和尚洞为例,采用16s rDNA克隆文库测序法研究了HS-3D滴水中细菌群落的群落组成,构建HS-3D滴水中细菌的进化树,揭示洞内滴水细菌群落组成随时间而呈现的季节性变化,探求这种变化与石笋中的类脂物以及气候变化的相关关系,发掘分子生物学方法在古气候重建中的应用潜力。运用16S rDNA克隆文库测序法在2006年2月、5月、8月和11月份HS-3D滴水中共得到11个克隆。通过在NCBI网站上查询,他们分别与不动杆菌属、α-变形菌、噬纤维菌目、β-变形菌、食酸菌属的菌株亲缘关系最近。结合前期本实验室对HS-3D滴水中细菌的研究数据,构建了HS-3D中细菌的进化树。纵观HS-3D中的细菌,2006年2月份的菌群较为单一,全部为不动杆菌属的,2006年11月份的次之,2006年5月和8月份的菌种较为多样,各个月份中的细菌都大不相同,呈现出较好的季节性变化。但由于本研究得到的克隆较为稀少,而且仅是一年的数据,还不足以得出某一类或者某几类细菌的存在与否能够作为季节的特征。但是本实验得到了一些使用传统的培养方法无法得到的细菌,此方法比运用纯培养的方法得到的数据更全面。如果此项研究能够继续坚持下去,并且对研究方法进行改进,每个月份得到更多的序列后,将会对微生物与洞内环境,气候变化的响应关系给予更好的诠释,对洞内石笋类脂物的来源提供可靠的分子微生物数据,也将能在古气候重建中发挥重要作用。