研究背景：子宫内膜异位症(Endometriosis, EM)是育龄妇女的多发病,所引起的盆腔包块、痛经和为孕严重影响女性生殖健康和生活质量。证候是疾病一定阶段病因、病位、病性、病势的综合表现,是中医药理论研究的核心内容,开展中医“证”本质研究,揭示证候的科学内涵是中医基础理论现代化的关键环节,而证候生物学基础研究的突破则是证候科学内涵得以阐明的保障。血瘀证是中医临床各科的基本证型,也可见于多种妇科疾病中,同时也是子宫内膜异位症的常见证型。导师所带领的课题组已在前期研究中,提出了EM血瘀证以“湿瘀互结”为病机关键,并发现该证型的异位和在位内膜在组织形态学和细胞凋亡相关因子的表达存在差异,为从蛋白组学水平探索EM的不同证候的特异性标志物的研究工作奠定了基础。对子宫内膜异位症血瘀证进行深入、系统的现代研究,有助于对本病的准确诊断和有效治疗。蛋白质组学方法能够整体性、高通量地反映组织或细胞内蛋白质水平的变化,已成为目前研究疾病发病机制、筛选肿瘤标记物、寻找药物作用和基因干预靶点等的有力手段。目的：①通过蛋白组学技术分离并鉴定EM血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者在位内膜的差异蛋白质,寻找EM证候特异性蛋白质；②应用免疫组化方法对EM血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者在位内膜的血管生成相关因子(VEGF、Ang-2、Tie-2)、细胞凋亡相关因子(survivin、PCNA、Livin)、细胞周期调节因子(细胞周期蛋白D1、P16)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、T细胞调节因子(转录因子Foxp3)的表达进行检测,寻找其表达差异；③从蛋白质水平探讨EM血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证的实质,揭示EM血瘀证辨证的分子生物学基础,建立EM的蛋白质分子微观辨证和诊断体系,探讨EM证候的演变规律、证候的辨治靶点,寻找有意义的分子标记物及基因干预的靶点；④为EM中医证候相关蛋白质库的建立奠定基础,为中医辨证的客观化和标准化提供实验依据,以规范中医辨证,提高中医辨证治疗的准确性和临床疗效,通过“治病求本”,实现“源头治疗”和“靶向治疗”。方法：分别取6例子宫内膜异位症血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者增生期在位内膜组织和6例增生期正常子宫内膜组织标本,配对分为6组。提取组织总蛋白,通过双向电泳技术分离总蛋白,并得到6组双向电泳凝胶图谱。通过PDQuest7.1.1软件对图像进行裁剪、斑点检测和匹配分析,评价图像的匹配率,并检测出表达差异点。将差异点切下后进行胶上原位酶解,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)及蛋白质数据库检索进行蛋白质鉴定,在鉴定出的差异点中选择表达恒定,差异明显且稳定,质谱结果理想可靠的蛋白作为子宫内膜异位症血瘀证相关蛋白候选分子。采用免疫组织化学方法对VEGF、Ang-2、Tie-2、MIF、survivin、 PCNA、Livin、Cyclin D1、P16、Foxp3在子宫内膜异位症患者在位内膜与正常子宫内膜组织间的表达差异进行了研究,检测以上指标在18例子宫内膜异位症血瘀证在位内膜和6例增生期正常子宫内膜组织石蜡标本中的表达,对结果用Image pro-Plus5.0软件测定IOD值,应用统计学方法对其在子宫内膜异位症血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者的在位内膜与正常组织间的表达差异性进行分析。结果：①得到6组分辨率高、重复性好的人子宫内膜异位症血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证在位内膜与正常子宫内膜的双向电泳图谱,检测的平均斑点数为182±28,各组内两张胶的匹配率(%)平均为85.625±4.2。共筛选出66个差异点,胶上差异明显,重复次数在3次以上。经质谱分析和数据库检索成功鉴定出22个蛋白,质谱结果理想。对鉴定出的差异蛋白进行了功能和细胞定位的分析归类,这些差异蛋白的主要功能涉及细胞骨架、呼吸和脂肪代谢、细胞凋亡和增殖等方面。②免疫组化研究提示,Ang-2等10个指标在3种证型患者之间、患者与健康妇女之间表达情况的6组比较中,Ang-2、MIF、Foxp3有4组结果有显著性差异；VEGF、P16有3组结果有显著性差异；Livin、PCNA有2组结果有显著性差异；Cyclin D1、Tie-2有1组结果差异有显著性差异；survivin在各组均无显著性差异。结论：①根据蛋白质的不同等电点和分子量,通过双向凝胶电泳和质谱分析技术可以分离人EM患者及健康妇女在位内膜,利用分析软件,可发现EM血瘀证患者与健康妇女在位内膜之间有差异蛋白表达,这些差异蛋白可能成为EM发病的候选生物标志物。EM血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者在位内膜之间蛋白质组成分存在差异,这些差异可能是证候实质的内在根源。②Ang-2、Foxp3、MIF可能是潜在的EM血瘀证及其主要相关复合证肾虚血瘀证、气滞血瘀证的辨证相关分子标志物；Survivin在各组的表达特异性较差,不适于作为指导诊断和辨证的备选分子。