金黄色葡萄球菌作为重要的致病菌,主要引起皮肤脓肿、菌血症、致死性肺炎和化脓性心内膜炎等。金黄色葡萄球菌同时也能以定植菌的形式,持续或者暂时存在于约10-30%的人群中,当宿主皮肤破损或免疫力低下时迁移至适当的位置而引发感染。19世纪60年代出现了被称为“超级细菌”的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA以来,金黄色葡萄球菌日益严重的耐药情况使得对于其感染的治疗成了临床医生一大棘手的问题。研发新的抗金黄色葡萄球菌的药物或者疫苗迫在眉睫,发现新的有效药物或者疫苗的靶点已经成为了目前国际研发的新热点。金黄色葡萄球菌的表面表达多种功能各异的蛋白,它们通常以共价的形式锚定在金黄色葡萄球菌细胞壁的肽聚糖上,因此这些表面蛋白被称为细胞壁锚定蛋白。近年来多个研究报道证实了多种细胞壁锚定蛋白在金黄色葡萄球菌的定植和感染中起到重要作用。因为表达于金黄色葡萄球菌的表面,细胞壁锚定蛋白不仅易于被药物分子或者抗体接触,而且大多为细菌的重要毒力因子,因此常常成为药物或者疫苗研发的新靶点。MRSA ST239克隆株在中国以及亚洲其它国家医院环境内广泛流行。我们通过基因组比对研究发现了一种新的细胞壁锚定蛋白,它与表皮葡萄球菌的毒力因子SesI同源性极高。通过已有的对于SesI的研究报道,我们推测MRSA ST239克隆株中的这一新的细胞壁锚定蛋白可能在MRSA ST239菌株在医院环境内的持续感染中发挥重要的作用。我们将其命名为SasX(Staphylococcus aureus surface protein X)。本研究希望通过对这一新的细胞壁锚定蛋白SasX在金黄色葡萄球菌中的分布特点、在定植和感染中的作用以及其作为疫苗研发新靶点的可行性进行研究,以期能够明确MRSA ST239在医院内持续感染的分子机制,为抗金黄色葡萄球菌感染的新药物或疫苗提供可能的研发靶点。(1)新的细胞壁锚定蛋白SasX的发现及其编码基因在金黄色葡萄球菌中的分布在中国以及亚洲其它国家医院环境内广泛流行的MRSA克隆株为ST239菌株。通过对其基因组的比对分析,我们发现了一段新的细胞壁锚定蛋白编码序列,将其编码的蛋白命名为SasX。SasX与表皮葡萄球菌SesI氨基酸同源性高达95%,通过对SesI蛋白功能的研究,我们推测SasX蛋白可能在金黄色葡萄球菌ST239克隆株在医院环境内持续感染中起到重要作用。本部分首先应用分子流行病学方法对sasX基因进行分析。随机收集中国华东地区三家教学医院从2003年至2011年间共807株金黄色葡萄球菌菌株和来自社区健康人鼻腔定植的金黄色葡萄球菌菌株170株进行了sasX基因的扩增分析,发现sasX主要存在于医院环境内致病性的金黄色葡萄球菌中,而在健康人鼻腔内分离的金黄色葡萄球菌中sasX的阳性率为0.59%。sasX在ST239菌株中的阳性率持续上升,在其他克隆株中也逐渐出现sasX阳性的菌株,如ST5、ST88等。通过对不同sasX阳性的不同的克隆株中sasX周围基因环境的分析发现sasX基因均存在于φSPβ样原噬菌体中,这一结果提示携带sasX基因的φSPβ样原噬菌体可以在不同克隆株之间传播,从2003年-2005年至2009年-2011年,携带sasX基因的MRSA比率从26.9%上升至45.2%,而携带sasX基因的MSSA的比率只约占10%。通过分析临床分离的sasX阳性和sasX阴性金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药性差异提示sasX基因的存在可能与细菌的耐药有关。本部分的研究结果显示,SasX是金黄色葡萄球菌在医院环境内持续感染的毒力因子之一,sasX可能在细菌的致病力中起到重要的作用。(2)SasX在金黄色葡萄球菌生物膜形成和致病中的作用分析采用基因敲除及基因互补技术获得MRSA ST239 HS770菌株、HS605菌株和MRSA ST5 HS72菌株的sasX基因敲除株及基因互补株。应用半定量生物膜形成实验检测sasX基因敲除前后对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响,与野生株相比,sasX基因敲除株生物膜形成能力明显减弱。在进一步的初始粘附实验中,sasX基因敲除株粘附能力明显减弱。SasX可以通过影响细菌的初始黏附从而影响生物膜的形成。使用小鼠的皮肤脓肿形成模型和肺炎模型研究SasX对金黄色葡萄球菌毒力的影响。在小鼠皮肤脓肿形成模型中,实验结果提示sasX基因敲除前后均能引起小鼠皮肤脓肿的形成,但sasX基因野生株接种小鼠皮肤脓肿形成面积在同一时间点上明显大于sasX基因敲除株,证明SasX在小鼠皮肤脓肿中起到重要的作用；在小鼠肺炎模型中,sasX基因野生株与其相应的敲除株相比较在湿肺组织/体重比值、由检测TNF-α水平而鉴定的肺组织中引起炎症程度及病理切片观察肺组织病变程度的结果均证明了SasX在小鼠肺炎感染中起到一定的作用。细菌对于免疫系统的逃逸能力与其致病性密切相关,而中性粒细胞是机体抵抗细菌感染的主要效应细胞。sasX基因敲除株比起其相应的携带有sasX基因的临床菌株具有更高的被中性粒细胞吞噬的机率。对于吞噬过程的研究显示,野生株具有明显的溶胞作用。sasX基因能够帮助细菌逃避宿主免疫系统的杀伤,促进细菌的致病性。(3)SasX在金黄色葡萄球菌粘附聚集和定植中的作用分析SasX在生物膜形成中的作用提示SasX可能在金黄色葡萄球菌的粘附聚集能力中起到重要的作用。使用普通显微镜直接观察sasX基因敲除前后细菌自身的粘附聚集能力发现,与野生株相比,sasX基因敲除株自身的聚集能力明显减弱,而互补表达株的自身聚集能力与野生株无明显差异。金黄色葡萄球菌对于人类鼻腔表皮细胞的粘附在细菌的定植、播散和致病中有着重要的影响,鼻腔是金黄色葡萄球菌在人体中重要的定植部位。通过粘附实验检测sasX基因突变前后对金黄色葡萄球菌粘附至人体鼻腔上皮细胞的能力,并通过阻断实验检测表达纯化的SasX蛋白对金黄色葡萄球菌粘附至人体鼻腔上皮细胞的阻断能力,从而分析SasX蛋白对金黄色葡萄球菌定植能力的影响。结果显示,与野生株相比,突变株粘附至人体鼻腔上皮细胞能力明显减弱,互补表达株粘附能力则明显增强。表达纯化的GST融合蛋白SasX和人体鼻腔上皮细胞的预培养对于野生株粘附至人体鼻腔上皮细胞的能力具有明显的抑制作用。作为鼻腔定植的体内实验,小鼠鼻腔定植模型的结果显示ST239和ST5的sasX基因敲除株在小鼠鼻腔内的定植能力比起其相应的野生株明显下降。在sasX基因野生株和基因敲除株的定植竞争实验也显示sasX基因敲除株的定植能力明显弱于野生株。研究结果表明,新的细胞壁锚定蛋白SasX影响金黄色葡萄球菌粘附聚集和定植能力,金黄色葡萄球菌通过获得sasX基因更加容易定植到宿主易感部位,进而引发感染。(4)SasX作为金黄色葡萄球菌疫苗靶点可行性的初步研究通过对SasX蛋白功能的研究结果显示,这一新的细胞壁锚定蛋白是金黄色葡萄球菌的重要毒力因子。本部分以SasX作为靶点通过主动免疫和被动免疫方式展开研究,以初步探索其是否具有成为研发抗金黄色葡萄球菌感染疫苗有效靶点的可行性。在小鼠的主动免疫实验中,我们使用纯化的SasX重组蛋白与弗氏佐剂乳化后制成的疫苗免疫小鼠,对其血清进行检测发现有高滴度的抗SasX抗体产生,这说明SasX蛋白具有很好的免疫原性,可以使被免疫小鼠产生特异性的免疫应答。使用不完全佐剂加强免疫一周后特异性抗体滴度达到最高。特异性抗体第一次免疫后一周以IgG2a和IgG2b为主,不完全佐剂加强免疫一周IgG1升高成为浓度比例最高的抗体亚型。通过小鼠皮肤脓肿模型、小鼠肺炎模型以及小鼠菌血症模型三个动物体内模型显示：以纯化的SasX蛋白与弗氏佐剂制成的疫苗免疫小鼠后,产生的特异性抗体具有明显的免疫保护作用,组织炎症反应及损伤程度和感染死亡率明显降低。使用纯化的SasX重组蛋白与弗氏佐剂制成的疫苗免疫兔子后,成功纯化获得含有抗SasX的总IgG,用其进行的动物被动免疫体内试验显示：较SasX蛋白主动免疫动物相比,使用抗SasX蛋白抗体被动免疫动物后抗感染能力与对照组未见显著差异。所制备多抗的低活性是这一结果可能的原因之一。另外还需要增加实验动物的数量以更好地评估抗SasX多克隆抗体在免疫保护中的作用。该部分实验结果初步提示SasX蛋白作为金黄色葡萄球菌疫苗靶点具有一定的可能性,对这一新的细胞壁锚定蛋白在疫苗中的应用具有进一步实验研究的意义。