目的众所周知,胰腺癌是一种主要起源于胰腺导管细胞的恶性肿瘤,预后极差,5年生存率小于5%,死亡率非常高。近年来,国内外胰腺癌的发病率均呈持续上升趋势。尽管内外科治疗技术都有了很大的改进,但近20年来胰腺癌患者的预后并没有明显的改善,手术切除患者的生存率仅为17%。因此深入探索胰腺癌的发生发展机制及内在的分子生物学特性,寻找有效的治疗靶点和有效的药物是当前急需解决的问题。瘦素是由脂肪细胞分泌的一种蛋白(16kD),循环系统中瘦素水平升高会通过抑制食欲和增加产热来抵制肥胖,传统观点把瘦素看成抑制肥胖的激素。但最近的研究表明,瘦素在其他诸如很多恶性肿瘤的发生进展、新陈代谢、神经内分泌、免疫调节等方面亦具有非常重要的作用。2003年Somasundar等人报道,leptin促进乳腺癌、食管癌、前列腺癌细胞的增殖,却抑制胰腺癌细胞的增殖,然而到目前为止其分子机制尚未探明。瘦素是通过结合瘦素受体(Ob-R)的胞外结构域发挥其作用,瘦素和瘦素受体的分子功能和生物学过程几乎是相同的。而胰腺癌组织中血液供应差,因此严重缺氧是胰腺癌的一个突出特点,HIF-1α在胰腺癌中过表达。有文献报道说,在结肠癌、子宫内膜癌等癌症中,leptin、Ob-R表达水平与HIF-1α的表达水平可能存在在着某种相关性,但具体调控机制尚不明确,因此本研究拟在阐明低氧诱导因子-1α(一个关键的转录因子)和人瘦素受体(Ob-R)之间的调控机制,从而为胰腺癌的预防和治疗寻找新的有效靶点,切实提高胰腺癌的治疗水平。方法一、HIF-1α对Ob-R的转录调控1、收集临床资料完整的胰腺癌组织标本,采用RT-PCR方法分析胰腺癌组织中Ob-R、HIF-1αmRNA的表达情况,并分析两者之间的相关性。2、细胞培养和处理:选择人胰腺癌细胞Mia-PaCa-2、ASPC-1等为研究对象。细胞分别经DMEM、1640培养基常规传代培养,待细胞生长至对数生长期时,将细胞用作做不同的试验处理。3、细胞转染、干扰和过表达:采用瞬时转染法干扰和过表达HIF-1α。4、Western blot检测干扰、过表达HIF-1α及低氧前后HIF-1α、Ob-R蛋白表达水平的变化。5、实时定量PCR检测干扰、过表达HIF-1α及低氧前后HIF-1α、Ob-RmRNA表达水平的变化。6、染色体免疫共沉淀实验(ChIP):参照ChIP分析试剂盒试验方法操作,然后用逆转录PCR法来检测HIF-1α和Ob-R基因启动子的结合状况。7、双荧光素酶实验:构建Ob-R基因启动子荧光素酶表达载体,与HIF-1α过表达载体共转染细胞,观察HIF-1α对Ob-R基因的转录调节效应。二、HIF-1α调控胰腺癌细胞中Ob-R表达的功能学验证1、细胞培养及处理:本研究选择人胰腺癌细胞Mia-PaCa-2、ASPC-1为研究对象。细胞分别经DMEM、1640培养基常规传代培养,待细胞生长至对数生长期时,用不同浓度Leptin处理。2、采用MTT法绘制药物作用不同浓度细胞生长曲线:收集细胞,按照每孔1×104个细胞设6个复孔,分为5组,各组了 leptin浓度分别为0、50、100、250、500ng/ml,leptin分别作用24h、48h、72h后行MTT检测,绘制细胞生长曲线。3、细胞凋亡检测:分别用0、100、250、500ng/ml Leptin处理细胞后,于24h后收集2ml处理后的细胞,离心洗涤后经碘化丙锭(PI)和AnnexinV-FITC染色,采用流式细胞仪检测细胞凋亡。4、细胞周期检测:分别采用0、100、250、500ng/mlLeptin处理细胞,24h后收集1ml处理后的细胞,离心洗涤后用75%的酒精固定24h,经碘化丙锭(PI)染色,采用流式细胞仪检测细胞周期。5、MTT法检测细胞存活率:用瞬时转染法沉默胰腺癌细胞系中HIF-1α,48h后用不同浓度leptin处理细胞处理细胞,然后用MTT法检测24、48、72h后对照组、leptin处理组和对照组的细胞存活率。6、EdU法检验细胞增殖:用瞬时转染法沉默胰腺癌细胞系中HIF-1α,48h后用500ng/ml leptin处理细胞,然后EdU试剂盒的说明书进行操作,检测沉默HIF-1α后对照组和干扰组细胞增殖情况。结果配对胰腺癌组织中HIF-1α和Ob-R的表达水平明显高于相应对的癌旁组织,HIF-1α和Ob-R的表达具有显著相关性(r=0.724,P<0.05)。在胰腺癌细胞中低氧和过表达HIF-1α均在蛋白和mRNA水平上增强Ob-R的表达。通过siRNA干扰技术沉默胰腺癌细胞中HIF-1α的表达,Ob-R在蛋白和mRNA水平的表达明显降低了。查阅NCBI数据库,分析Ob-R基因启动子,发现在转录起始位点上游的地区有三个缺氧反应元件(HRE)。利用ChIP实验中,我们发现,HIF-1α是通过直接绑定到位于Ob-R基因启动子区-832到-828的低氧反应元件(HRE)来发挥转录调控作用的。荧光素酶报告分析显示过表达HIF-1α能显著地增加Ob-R启动子的活性,分别是对照组的3.43倍(ASPC-1)和 3.76 倍(Mia-PaCa-2)(P<0.05)。leptin 抑制胰腺癌细胞(ASPC-1 和 Mia-PaCa-2)的增殖(P<0.05)。用 siRNA干扰技术沉默细胞中的HIF-1α的表达后用leptin处理胰腺癌细胞系ASPC-1和Mia-PaCa-2。MTT检测细胞存活率,发现siRNA干扰组的增殖抑制率小于对照组(P<0.05)。进一步我们用EdU检测细胞增殖,发现500ng/ml leptin处理组EdU阳性率小于对照组。结论:1.在胰腺癌细胞系中,HIF-1α通过直接与Ob-R基因启动子的HRE区结合来调控瘦素受体Ob-R的表达,激活Ob-R的表达。2.Leptin抑制胰腺癌细胞增殖,用siRNA干扰技术沉默细胞中的HIF-1α的表达后,leptin抑制胰腺癌细胞增殖的作用减弱了。提示HIF-1α对leptin/Ob-R的调控可能成为胰腺癌预防治疗的一个新思路。