镍是人和动物体内必需的微量元素,也是在日常生活、制造业和国防工业中广泛应用的一种金属。目前已证实镍是较为严重的一种具有致癌性和毒性的工业和环境污染物,其毒性和蓄积的靶器官之一是肾脏。前期研究发现过量氯化镍（Ni Cl2）可诱导肾脏毒性,但关于自噬在其中的作用及相关机制尚不清楚。因此,本试验选用7周龄健康ICR小鼠和体外培养小鼠肾小管上皮细胞（TCMK-1）为研究对象,建立体内和体外Ni Cl2肾脏中毒模型以及氧化应激、自噬、线粒体自噬和凋亡干预模型,探讨Ni Cl2对肾脏细胞自噬的影响规律及分子机理,明确自噬在Ni Cl2致肾脏细胞凋亡中的作用及机制,为阐明Ni Cl2致肾脏毒性的作用机制提供新的依据。第一部分Ni Cl2对肾脏细胞自噬的影响及机制研究1.Ni Cl2对肾脏细胞自噬的影响及分子机制试验选用7周龄ICR雄鼠和TCMK-1细胞为研究对象。通过灌胃给予小鼠不同剂量Ni Cl2（0 mg/kg、7.5 mg/kg、15 mg/kg、30 mg/kg）,连续28天,建立Ni Cl2体内中毒模型;通过添加不同剂量Ni Cl2（0μM、200μM、400μM、800μM）的培养基来处理TCMK-1细胞24 h,建立Ni Cl2体外中毒模型。在体内试验中,病理组织学和肾功能指标结果显示Ni Cl2可诱导小鼠肾脏损伤,表现为:肾脏指数降低;肾小球肿胀、肾小囊囊腔间隙变窄、肾小管上皮细胞出现空泡和颗粒变性;肾功指标CRE和BUN显著升高。免疫组化检测发现Ni Cl2组肾脏中的LC3表达明显增高,而p62的表达明显降低。电镜观察可见Ni Cl2诱导肾脏组织中的自噬溶酶体数量增多。蛋白印迹和q RT-PCR结果显示,Ni Cl2处理后,p62、PI3K、AKT、m TOR蛋白和m RNA表达水平显著降低,而LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5/12/7/3/16L1、AMPKα和ULK1蛋白和m RNA表达水平显著升高。在体外试验中,MTT法检测结果显示Ni Cl2可显著降低细胞的活性。显微镜观察发现,Ni Cl2处理导致细胞密度下降,细胞形态变圆及间隙增宽。电镜观察可见Ni Cl2诱导细胞中出现大量自噬小体。免疫荧光检测显示,Ni Cl2诱导LC3的表达升高。蛋白印迹和q RT-PCR结果显示,p62、PI3K、AKT、m TOR、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5/12/7/3/16L1、AMPKα和ULK1蛋白和m RNA表达水平同体内试验变化一致。为进一步验证Ni Cl2通过AKT/AMPK-m TOR信号通路诱导了肾脏细胞自噬,本研究选用AKT促进剂（SC79）和AMPK抑制剂（Com C）分别对Ni Cl2中毒细胞试验进行干预。结果表明,SC79处理后,AKT-m TOR通路被激活,Ni Cl2诱导的自噬被抑制;Com C处理后,AMPK通路被抑制,自噬也被抑制。2.Ni Cl2通过氧化应激诱导肾脏细胞自噬参照第一部分的方法建立Ni Cl2中毒的体内外模型。此外,采用抗氧化剂NAC建立氧化应激干预的小鼠体内动物模型;分别选用NAC和线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO建立氧化应激干预的体外细胞模型。在体内试验中,流式细胞术和生化检测结果显示,Ni Cl2诱导肾脏ROS和MDA的含量显著升高,而抗氧化指标T-AOC、CAT、SOD和GSH显著下降;而NAC可缓解Ni Cl2对上述指标的影响。病理组织学检测和肾功能指标结果显示,NAC减轻了Ni Cl2造成的肾脏损伤。蛋白印迹结果显示,与Ni Cl2处理组相比,NAC与Ni Cl2共处理后,LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p-AMPKαThr172/AMPKα的蛋白水平显著降低,p62、p-AKTSer473/AKT和p-m TORSer2448/m TOR的蛋白水平明显升高。在体外试验中,流式细胞术和荧光显微镜观察显示,Ni Cl2处理组细胞中的ROS水平明显增高;而NAC与Ni Cl2共处理可显著降低ROS水平。MTT法检测显示NAC可缓解Ni Cl2对细胞活性的抑制。蛋白印迹结果显示,NAC与Ni Cl2共处理,细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62、p-AMPKαThr172/AMPKα、p-AKTSer473/AKT和p-m TORSer2448/m TOR表达水平的变化同体内NAC干预试验结果一致。此外,线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO干预,也得到了与NAC干预一致的结果。第二部分自噬在Ni Cl2致肾脏细胞凋亡中的作用及机制1.Ni Cl2对肾脏细胞凋亡的影响参照第一部分的方法建立Ni Cl2中毒的体内外模型。在体内试验中,TUNEL染色结果显示,Ni Cl2导致肾脏组织中阳性细胞数量显著增加。蛋白印迹和q RT-PCR结果显示,Ni Cl2处理后,肾脏中Bax、Caspase-3/8/9和RARP的蛋白和m RNA表达水平显著升高,而Bcl-2的蛋白和m RNA表达水平显著降低。在体外试验中,DAPI法染色结果显示,Ni Cl2诱导TCMK-1细胞中凋亡细胞的数量增多。流式细胞术结果显示,Ni Cl2可显著增高细胞凋亡率。蛋白印迹和q RT-PCR结果显示,Ni Cl2处理后,TCMK-1细胞中凋亡相关因子的蛋白和m RNA表达水平同体内试验结果变化一致。2.自噬在Ni Cl2致小鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用选用自噬抑制剂3-MA和自噬促进剂Rapa,建立自噬干预的体外细胞模型;选用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK,建立凋亡干预的体外细胞模型。在自噬干预的体外试验中,MTT法检测显示,3-MA可增强Ni Cl2对TCMK-1细胞活性的抑制,Rapa则减轻Ni Cl2对细胞活性的抑制。流式细胞术检测发现,3-MA和Ni Cl2共处理后,细胞凋亡率显著升高;而Rapa和Ni Cl2共处理后,细胞凋亡率显著降低。蛋白印迹结果显示,3-MA和Ni Cl2共处理后,LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著降低,p62、Bax/Bcl-2比值、Cleaved-Caspase-3/8/9和Cleaved-RARP蛋白水平明显升高;Rapa和Ni Cl2共处理后,LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,p62、Bax/Bcl-2比值、Cleaved-Caspase-3/8/9和Cleaved-RARP蛋白水平明显降低。以上结果表明,3-MA可增强Ni Cl2诱导的TCMK-1细胞凋亡,而Rapa可抑制细胞凋亡。在凋亡干预的体外试验中,DAPI染色显示,Z-VAD-FMK干预后,发生凋亡的细胞数量减少。流式细胞术结果显示,Z-VAD-FMK显著降低了细胞凋亡率。MTT法检测显示,Z-VAD-FMK可减轻Ni Cl2对细胞活性的抑制。蛋白印迹结果显示,Z-VAD-FMK显著降低了Bax/Bcl-2比值、Cleaved-Caspase-3/8/9和Cleaved-RARP的蛋白表达水平;而LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62则无明显变化,表明Z-VAD-FMK对Ni Cl2诱导的自噬无明显影响。3.线粒体自噬在Ni Cl2致小鼠肾小管上皮细胞凋亡的作用参照第一部分的方法建立Ni Cl2中毒的体内外模型。选用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1和线粒体自噬促进剂CCCP,建立线粒体自噬干预的体外细胞模型。在Ni Cl2体内外中毒试验中,蛋白印迹结果显示,Ni Cl2处理会显著升高小鼠肾脏和TCMK-1细胞中线粒体的LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62的蛋白水平,表明Ni Cl2在体内外均可升高线粒体自噬水平。在线粒体自噬干预的体外试验中,MTT法检测显示,Mdivi-1可增强Ni Cl2对细胞活性的抑制,CCCP则能明显减轻Ni Cl2对细胞活性的抑制。流式细胞术检测显示,Mdivi-1和Ni Cl2共处理后,细胞凋亡率显著升高;而CCCP和Ni Cl2共处理后,细胞凋亡率显著降低。蛋白印迹结果显示,Mdivi-1和Ni Cl2共处理后,线粒体中LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62的蛋白水平明显降低;CCCP和Ni Cl2共处理后,线粒体中上述蛋白表达水平继续升高。凋亡蛋白检测结果显示,Mdivi-1和Ni Cl2共处理后,Bax/Bcl-2比值、Cleaved-Caspase-3/8/9和Cleaved-RARP蛋白水平升高;CCCP和Ni Cl2共处理后,上述凋亡蛋白的表达水平降低。以上结果表明,Mdivi-1可增强Ni Cl2诱导的细胞凋亡,而CCCP则可抑制细胞凋亡。结论:Ni Cl2诱导的小鼠肾脏损伤伴随着自噬水平的升高,且氧化应激介导的AKT和AMPK-m TOR通路参与了Ni Cl2对自噬水平升高的诱导。同时,自噬水平的升高可抑制Ni Cl2诱导的小鼠肾小管上皮细胞凋亡,在Ni Cl2肾毒性中起着保护作用,且Ni Cl2肾毒性中线粒体自噬可能是自噬抑制细胞凋亡的重要机制之一。