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人体受大剂量射线照射后免疫力降低,容易被病原微生物感染,加重放射损伤的病情。辐照后服用正确的抗生素可以有效缓解感染。但近年来,由于抗生素滥用致使耐药菌感染的病例频发,越来越多“超级细菌”的出现对本身免疫力降低的受辐照患者来说非常不利。抗菌肽是一类可以杀灭细菌、原生动物、真菌和病毒的小分子多肽,广泛存在于微生物、植物、动物体内,是机体天然免疫的重要组成成分。人防御素5(human defensin5,HD5)是小肠隐窝基底部潘氏细胞分泌的阳离子抗菌肽,是人体6种α防御素中抗菌谱最广的分子,有望被开发为新型抗生素。由于HD5在复杂的体液环境中抗菌活性受限,课题组前期通过适应性进化位点突变,成功筛选到衍生肽T7E21R-HD5。该多肽稳定性好,抗菌作用突出,且不易被耐药菌耐受,具有较好的药物开发前景。肠源性抗菌肽是理想的肠道感染抗生素替代物,如何将活性多肽递送到肠腔、实现药物在肠道中的可控释放,是将T7E21R-HD5开发为口服肠道抗生素需要解决的关键问题。为此,本研究以介孔二氧化硅纳米颗粒(mesoporous silica nanoparticle,MSN)为载体,以琥珀酰酪蛋白(succinylated casein,SCN)为外衣,成功制备出了可在肠道中可控释放的MSN@T7E21R-HD5@SCN复合纳米抗生素,并探讨了其对外源细菌性感染肠炎及放射性肠炎的救治作用。此外,基于T7E21R-HD5的结构-效应关系研究,我们利用丙氨酸和精氨酸突变,设计并筛选出在体外和体内均具有高效抗多重耐药鲍曼不动杆菌的线性多肽,探讨其对辐射后小鼠肺部感染的作用。进一步推进了T7E21R-HD5的药用开发。本研究取得的主要成果如下:1.利用溶胶凝胶法制备的MSN粒径均一、分散性好,可通过静电吸附作用负载T7E21R-HD5多肽,负载率高达70%。通过孔径和比表面积检测、醋酸尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳成像、X射线能量色散谱以及质谱检测等方法对MSN@T7E21R-HD5进行鉴定,确定多肽成功负载。2.最低抑菌浓度(MIC)检测和激光共聚焦结果显示,MSN@T7E21R-HD5致死革兰阴性大肠杆菌(ATCC 25922)、临床多重耐药大肠杆菌以及革兰阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA,ATCC 43300)的能力显著强于T7E21R-HD5。与之相对应,MSN@T7E21R-HD5诱导大肠杆菌菌膜去极化的作用优于游离多肽。3.MSN@T7E21R-HD5呈浓度依赖地破坏细菌内、外膜,效应明显强于等浓度T7E21R-HD5。激光共聚焦和扫描电镜观察到MSN@T7E21R-HD5以吸附-聚集-渗透-崩解步骤杀灭细菌。而且,相同多肽浓度时,相较于T7E21R-HD5,MSN@T7E21R-HD5对细菌膜的机械损伤更大。4.MSN@T7E21R-HD5表面修饰SCN后,纳米颗粒粒径增大。电位检测、醋酸尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳成像以及透射电镜证实SCN的成功包裹。SCN修饰显著降低T7E21R-HD5在强酸环境中的释放,减少了多肽在胃酸环境中损失。在胰酶的催化作用下,SCN包裹能够实现MSN@T7E21R-HD5在肠道中的可控释放。5.MSN@T7E21R-HD5@SCN溶血性和细胞毒性低,体内毒性低。口服MSN@T7E21R-HD5@SCN能够显著降低外源性多重耐药大肠杆菌在肠腔中的定殖,减少细菌侵袭引起的炎症因子释放,缓解感染症状。口服MSN@T7E21R-HD5@SCN还可以缓解肠型放射病腹泻症状,降低菌血症的发生率,减少小鼠血清内毒素的含量。6.保留T7E21R-HD5的C端活性区域,将半胱氨酸替换为丙氨酸,非疏水和非正电荷氨基酸替换为精氨酸,可以得到线性肽T7E21R-HD5-d3;该衍生肽在水溶液和脂环境中分别呈现无规则卷曲和α螺旋结构,可以通过固相化学合成法制备。7.T7E21R-HD5-d3抗多重耐药鲍曼不动杆菌(鲍曼)活性极强,MIC低至2.5μg/mL。T7E21R-HD5-d3生物安全性好,滴鼻给药可以显著提高辐照后肺部感染小鼠的存活率,降低耐药鲍曼在肺部的定殖。8.生物膜干涉、NPN摄取实验以及扫描电镜结果提示,T7E21R-HD5-d3结合鲍曼外膜蛋白A和破坏细菌外膜的能力显著强于T7E21R-HD5。此外,亚致死剂量的T7E21R-HD5-d3能够渗透进入鲍曼胞内并结合50S核糖体蛋白,干扰核糖体蛋白质合成,抑制细菌生长。