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研究背景及目的:甲苯二异氰酸酯(toluene diisocyanate,TDI)是一种用于制造多种合成材料的化学中间物。在日常生活中十分常见,TDI也是诱导哮喘的一类重要有毒化学品。既往我们课题组及其他人的研究已经表明,AKT信号通路在哮喘发病过程中有重要的作用,但在哮喘的气道炎症和重塑的作用尚不清楚。MK2206是一类新型的AKT活化抑制剂,其是否能抑制哮喘的气道炎症和重塑及分子机制尚不清楚。因此,本研究旨在通过构建TDI诱导的哮喘小鼠模型,评估MK2206对该模型的气道炎症以及气道重塑的潜在作用及其可能的分子机制。实验方法:1、体内实验1.1构建TDI诱导的哮喘小鼠模型并分为四组:(1)AOO组(对照组,即丙酮+橄榄油致敏、丙酮+橄榄油激发);(2)TDI组;(3)TDI+MK2206组,即TDI致敏、TDI激发,且在激发前通过灌胃给予AKT抑制剂MK2206;(4)TDI+DEX组,即TDI致敏、TDI激发,且每次激发前经腹注射地塞米松。1.2(1)不同浓度乙酰甲基胆碱刺激后,检测各组小鼠气道反应性;(2)Elisa法检测小鼠血清总IgE水平和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞因子水平;(3)光学显微镜下评估BALF中炎症细胞总数和炎症细胞占比情况;(4)制作肺组织切片作苏木素&伊红染色,评估肺组织中气管周围和血管周围炎症细胞浸润情况并进行评分,比较各组评分差异;(5)蛋白免疫印迹法(WB)检测小鼠肺组织炎症分子HMGB1的表达水平。1.3(1)过碘酸-雪夫(PAS)染色评估各组小鼠气道上皮杯状细胞比例和气道上皮网状基底膜厚度;(2)免疫组化检测各组小鼠肺组织的α-SMA和磷酸化AKT(p-AKT)的表达;(3)蛋白免疫印迹法(WB)检测气道重塑分子(Ⅰ型胶原蛋白)collagen Ⅰ、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达及其与AKT磷酸化的关系。2、体外实验2.1体外使用TDI-HSA复合物刺激正常人气道上皮细胞系16HBEs,WB检测细胞中炎症分子HMGB1和气道重塑分子α-SMA的表达。2.2分别予AKT抑制剂MK2206和DEX预处理,用TDI-HSA刺激16HBEs,蛋白免疫印迹法检测细胞中HMGB1和α-SMA的表达;免疫荧光(IF)染色检测16HBEs胞内HMGB1和α-SMA的表达情况。3、统计学处理连续或有序数据的统计分析分别使用SPSS 20.0或GraphPad Prism 8进行。连续数据用均数±SEM表示,等级资料用四分位间距表示。比较多组间连续数据的差异,采用单因素方差分析后再进行Bonferroni事后检验;对有序数据采用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。p<0.05认为差异有统计学意义。实验结果:1.体内实验:1.1 成功构建TDI诱导的哮喘小鼠模型:与对照组小鼠相比,TDI诱导的哮喘小鼠的气道反应性明显增高,BALF中的炎症细胞因子(包括IL-4,IL-5,IL-6,IL-13)和血清总IgE水平显著上升;肺部炎症细胞浸润明显:BALF的炎症细胞增多,肺组织切片HE染色见TDI组小鼠气道旁和血管周围大量炎症细胞聚集,气管周围炎症评分和血管周围炎症评分高于对照组;同时,TDI哮喘小鼠肺组织的HMGB1表达上调。当予MK2206或DEX预处理后,TDI哮喘小鼠的气道高反应性下降,BALF中的炎症因子(IL-4,IL-5,IL-6,IL-13)和血清总IgE水平降低,且在DEX组IL-6降低水平比MK2206组的更明显。MK2206可以减少BALF的炎症细胞比例,显著减轻肺组织血管周围炎症细胞浸润。同时,WB显示MK2206和DEX使TDI哮喘小鼠肺组织匀浆HMGB1表达量显著减少,且MK2206组的HMGB1表达量下降比DEX组明显。1.2 相比对照组小鼠,PAS染色显示TDI诱导的哮喘小鼠气道上皮杯状细胞化生明显以及气道上皮网状基底膜厚度增厚;免疫组化显示TDI组气道上皮下α-SMA表达明显增多,TDI组气道上皮中AKT磷酸化增多;同时,WB显示TDI组小鼠肺组织collagen Ⅰ、α-SMA表达上调,且与AKT磷酸化水平趋势一致。当予MK2206或DEX预处理后,TDI哮喘小鼠的气道上皮杯状细胞化生现象和气道上皮网状基底膜厚度增厚得到改善,MK2206对气道上皮网状基底膜厚度增厚的抑制作用不及DEX组明显。免疫组化显示MK2206或DEX处理使TDI组气道上皮下α-SMA以及气道上皮中AKT磷酸化减少。WB显示在抑制TDI哮喘小鼠肺组织中α-SMA的表达上,MK2206和DEX的效果相当;在动物体内抑制HMGB1、collagen I表达和抑制AKT磷酸化方面,MK2206的效果优于DEX组。2.体外实验:2.1 TDI-HSA组细胞的HMGB1、α-SMA表达水平显著高于对照组,且与AKT磷酸化表达趋势一致。MK2206或DEX预处理可减少TDI-HSA诱导的16HBEs的HMGB1表达上调,MK2206抑制HMGB1表达的效果不及DEX。2.2 TDI-HSA组的细胞中HMGB1和α-SMA的表达和胞质内定位显著高于对照组,MK2206或DEX预处理使16HBEs胞质中的荧光信号强度变弱,HMGB1和α-SMA表达下降。结论:MK2206可以显著减轻TDI诱导的哮喘小鼠气道炎症和气道重塑,其机制可能与抑制AKT信号通路、下调HMGB1的表达和减弱上皮间质转化(EMT)有关。